《Forensic Science International: Genetics》：MitoMetrics: Incorporation of mtDNA profile discrepancies in likelihood ratio calculations
編輯推薦：
線粒體DNA（mtDNA）法證分析面臨組織間異質性挑戰，尤其是頭發樣本與血液/唾液樣本的差異。MitoMetrics項目首次通過多實驗室數據（含13起案件）量化mtDNA異質性水平，建立基于似然比（LR）的初步證據權重模型，考慮同源組織間的離散位點數量。研究發現頭發樣本異質性（MAF 10%）與血液/漱口樣本無顯著差異（p=0.48），但離散位點頻率影響證據價值。未來需擴大樣本量和納入系統發育分析。
Floor Claessens | Mikkel Meyer Andersen | Christina Amory | Cristina Arévalo | Stijn Desmyter | Sophie Dognaux | Kristiaan J van der Gaag | Tomasz Grzybowski | Gabriela Huber | Filomena Melchionda | Hiroaki Nakanishi | Tóra Olsen | Cristina Pie | Lourdes Prieto | Katarzyna Skonieczna | Chiara Turchi | Walther Parson | Vania Pereira
丹麥哥本哈根大學健康與醫學科學學院法醫學系法醫遺傳學部門
摘要
在法醫背景下解讀線粒體DNA（mtDNA）證據面臨諸多挑戰，尤其是在評估來自不同組織的mtDNA譜型時。例如，在頭發中，mtDNA的分割過程存在明顯的瓶頸效應，這可能導致同一 donor 的頭發之間以及頭發與其他參考組織之間的mtDNA譜型存在差異。
目前的mtDNA法醫解讀指南基于對兩個比對譜型之間不一致位點數量的判斷。大多數法規規定，兩個樣本之間的兩個不一致位點視為排除結果，一個不一致位點視為包含結果或不確定結果。需要更多數據來了解同一 donor 樣本中這些差異的分布和發生情況，以便將這些知識納入數學模型中，從而有效量化這些事件的概率。
本研究是 MitoMetrics 合作計劃的首個項目。研究數據來自多個參與實驗室以及先前發表的數據，還包括來自實際案例的數據。將血液/頰拭子參考樣本的mtDNA譜型與同一人的頭發樣本的mtDNA譜型進行了比較。結果報告了不同組織中檢測到的異質性水平、組織間觀察到的差異數量以及不一致位點的數量。
我們提出了一種初步模型，利用似然比方法計算基于mtDNA的證據價值，該模型考慮了同一 donor 樣本之間出現差異的情況。這是首次嘗試量化組織間出現差異的概率，并在法醫報告中加以應用。
引言
線粒體DNA（mtDNA）分析在案件調查中是一個重要元素，尤其是在犯罪現場僅收集到少量核DNA（nuDNA）的情況下[1]。如果核DNA的數量太少（例如少于100 pg），仍然可以通過mtDNA獲得信息，因為每個細胞中mtDNA的拷貝數量較多。mtDNA也存在于角化組織（如頭發和指甲，這些組織在犯罪現場較為常見）以及部分降解的組織（如骨骼）中[2]、[3]。然而，使用傳統方法在這種生物材料中擴增核DNA往往難以成功[4]。
mtDNA分析僅能提供關于母系血統的信息（以及在一定程度上提供生物學起源的信息）；它無法實現個體層面的識別[1]。然而，在尋找失蹤人員或處理大規模災難事件時，mtDNA仍然非常有用，因為可以使用幾代以后的母系親屬作為參考譜型來識別受害者[4]。mtDNA也可用于冷案調查，因為這些案件中通常含有非常古老和降解嚴重的樣本，可能無法產生可靠的DNA STR譜型[1]。
2000年，國際法醫遺傳學學會（ISFG）的DNA委員會制定了基于Sanger測序技術的mtDNA分型結果解讀指南[5]；這些指南在2014年得到了進一步完善[6]。最近，在2019年和2024年，DNA分析方法科學工作組（SWGDAM）發布了更新后的指南，其中包括了關于大規模并行測序（MPS）數據的說明[7]。這些指南基于mtDNA譜型之間觀察到的不一致位點數量來進行譜型解讀（無不一致位點——無法排除/包含；一個不一致位點——不確定；兩個或更多不一致位點——排除）。這種基于規則的方法沒有考慮系統發育信息或低水平的異質性。
異質性是在細胞分裂過程中產生的，指的是同一組織內存在不同的、盡管非常相似的mtDNA分子[8]。在同一人的不同組織中，mtDNA分子在分裂過程中的瓶頸效應可能導致不同的異質性水平[6]、[9]、[10]、[11]。有時，某一組織中的變異與個體其他參考組織（如血液和唾液）中的堿基 call 不同[2]、[8]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。這種情況在頭發中尤為常見，同一人的不同頭發之間，甚至同一根頭發內部都觀察到了差異[2]、[12]、[20]。在解釋犯罪現場提取的微量樣本與目標人員提供的參考樣本之間的mtDNA證據時，異質性的存在可能會產生影響。
大多數關于mtDNA異質性的研究都集中在控制區域或其高度可變片段上。只有少數研究針對mtDNA編碼區域[3]、[17]、[18]、[20]，而頭發中mtDNA編碼區域的異質性水平通常未知[21]。
需要更多數據來了解同一 donor 組織內mtDNA變異的頻率。這些知識可以納入統計模型中，以生成更基于數據、更能反映生物學現象的mtDNA證據報告模型。
這一廣泛的目標促成了 MitoMetrics 的成立，這是一個由法醫遺傳學領域的科學家和實踐者組成的臨時小組，旨在推動mtDNA在法醫遺傳學案件中的更廣泛應用。MitoMetrics 計劃的第一個項目專注于檢測和解讀mtDNA異質性，并將mtDNA譜型差異納入mtDNA證據權重的計算中。
本研究調查了來自頭發、血液和頰拭子的樣本的mtDNA序列變異情況，分析了同一人不同組織間差異的分布和頻率以及異質性水平。盡管可能存在特定于譜系的差異，但由于樣本量有限，無法得出關于異質性系統發育特征的可靠結論。通過比對結果不一致的樣本，開發了一種利用似然比方法來報告mtDNA證據權重的方法，該方法量化了同一 donor 組織間出現差異的概率。
案例數據
一個參與實驗室提供了來自實際案例的數據，包括13個案例（2個血液樣本、11個頰拭子樣本和34個頭發樣本），其中頭發樣本是從犯罪現場提取的，參考樣本是從嫌疑人身上采集的。樣本的毛根部分可用，并獲得了常染色體STR譜型，這強烈表明該個體是頭發和參考樣本的同一 donor。樣本被測序以獲取控制區域（CR）（16024-576 bp）或部分區域的數據。
血液、頰拭子和頭發樣本中的異質性
無論使用何種測序方法，MPS數據的點異質性平均頻率（MAF）為10%。補充表S4提供了更詳細的PHP（point heteroplasmies）及其MAF的概述。不同組織間的MAF沒有統計學上的顯著差異（Kruskal-Wallis檢驗：χ2(2) = 1.47, p = 0.48）。
圖1和補充圖S2展示了參考樣本（血液和頰拭子）和頭發樣本中檢測到的PHP事件頻率。
討論
頭發樣本是犯罪現場最常見的痕跡之一。目前，從沒有毛根的頭發樣本中獲取可行的常染色體STR譜型仍然很困難，在這種情況下，mtDNA分析可以提供更多關于嫌疑人的信息。然而，即使確定了目標人員并收集了生物參考材料并獲得了mtDNA譜型，mtDNA異質性的存在或樣本間的單個不一致位點仍可能使情況復雜化。
研究的局限性
本研究為基于mtDNA比較的統計分析提供了必要的知識和數據。然而，也應認識到一些局限性：i) 盡管許多參與者為該項目提供了數據，但樣本量和所代表的人群仍然有限，特別是當需要考慮系統發育關系時，這突顯了需要更大、更具代表性的數據集的必要性；ii) 關于頭發保養習慣的 donor 特異性差異也需要進一步研究。
結論
盡管這項研究仍處于起步階段，但它旨在將mtDNA法醫證據的解讀從基于規則的方法轉變為更基于生物學現象的方法。
未來的工作（和統計模型）應評估常見與罕見不一致位點的影響，以及單倍型在LR（likelihood ratio）計算中的頻率，因為當前研究的數據集不足以完全涵蓋這些現象的復雜性。
沿著這一方向，進一步的研究將很有意義。
編輯聲明
作為主編，Walther Parson 未參與本文的同行評審，也無法獲取有關同行評審的信息。本文的編輯工作完全由另一位期刊編輯負責。
資助
本研究得到了‘Fondo per la Ricerca Scientifica di Ateneo’、馬爾凱理工大學以及波蘭UMK研究大學卓越計劃（ForensOMICS小組和尼古拉斯·哥白尼大學盧德維克·雷迪吉爾醫學院）的財政支持（法定活動）。
作者貢獻聲明
Katarzyna Skonieczna：寫作、審稿與編輯、數據管理。
Cristina Arévalo：寫作、審稿與編輯、數據管理。
Lourdes Prieto：寫作、審稿與編輯、數據管理。
Christina Amory：寫作、審稿與編輯、數據管理。
Walther Parson：寫作、審稿與編輯、驗證、監督、方法論設計、概念構建。
Sophie Dognaux：寫作、審稿與編輯、數據管理。
Chiara Turchi：寫作、審稿與編輯、數據管理。
Stijn Desmyter：寫作、審稿與...
利益沖突聲明
作者聲明沒有利益沖突。
致謝
作者感謝Nadia Jochumsen在項目初期提供的實驗室技術支持，以及所有參與研究的志愿者。
