《Free Radical Biology and Medicine》：OXCT1-induced Succinylation at K81 Shields HADH from HSPA8-Mediated Degradation in alveolar epithelial cells to Attenuate Lung Ischemia-Reperfusion Injury
編輯推薦：
肺移植后肺缺血再灌注損傷（LIRI）的代謝調控機制研究。通過蛋白質組學和代謝組學分析發現脂肪酸氧化代謝紊亂主導LIRI，鑒定HADH為關鍵生物標志物（AUC=0.79）。HADH過表達通過改善線粒體功能、抑制氧化應激和細胞凋亡減輕損傷。研究揭示HADH催化域7個琥珀酰化賴氨酸位點，其中K81被OXCT1琥珀酰化穩定，與HSPA8結合受阻，抑制自噬降解。虛擬篩選提示靶向HSPA8的小分子藥物可能用于LIRI治療。
Jiwei Li|He Guan|Peng Miao|Zhijun Han|Chengzhi Ding|Zhe Jin|Li Wei
河南省人民醫院、鄭州大學人民醫院、河南工程學院附屬醫院胸部外科；鄭州肺病外科治療重點實驗室
摘要
肺移植是治療終末期肺病患者的一種救命手段，而肺缺血-再灌注損傷（LIRI）是其中的主要挑戰。通過針對關鍵致病分子來糾正肺泡上皮細胞中的脂質代謝紊亂是一種有前景的治療策略。定量蛋白質組學和代謝組學研究顯示，脂肪酸代謝紊亂在LIRI的代謝網絡中起主導作用。人類LIRI樣本的轉錄組分析表明，脂肪酸氧化和線粒體穩態受到破壞。在這一過程中，羥基酰基輔酶A脫氫酶（HADH）——一種關鍵的線粒體β-氧化酶——被確定為潛在的生物標志物（AUC = 0.79）。在暴露于60分鐘缺血和2小時再灌注（I/R）的Sprague-Dawley（SD）大鼠中，HADH的肺表達量下降了約50%。腺病毒介導的HADH過表達在體內和體外都表現出多方面的肺保護作用：在I/R處理后的SD大鼠中，它減輕了線粒體損傷，提高了ATP的產生，降低了ROS水平，并限制了肺泡凋亡；這些效應在暴露于2小時缺氧/4小時再氧合（H/R）的RLE-6TN AT2細胞中也得到了驗證。基于賴氨酸琥珀酰化調節線粒體酶活性的證據，我們進一步確定了HADH催化結構域中的7個琥珀酰化賴氨酸殘基，這突顯了其潛在的功能重要性。具體來說，3-氧代酸輔酶A轉移酶1（OXCT1）增加了HADH在賴氨酸81位點的琥珀酰化，通過伴侶介導的自噬（CMA）機制穩定了HADH。激活的OXCT1-HADH軸減少了非酯化脂肪酸的積累。OXCT1-琥珀酰化的K81位點破壞了HADH與熱休克蛋白A8（HSPA8）之間的結合，而HSPA8是CMA的識別因子。HADH具有典型的HSPA8結合CMA基序；突變其關鍵谷氨酰胺（Q132）或沉默HSPA8可以抑制CMA介導的HADH降解。虛擬篩選顯示，與HSPA8活性口袋（靠近其與HADH K81的相互作用區域）結合的小分子藥物在治療肺移植后功能障礙方面具有潛力。我們的發現闡明了HADH的琥珀酰化依賴性調控機制，并為LIRI提供了潛在的治療策略。
引言
肺移植仍然是終末期肺病患者的首選治療方法[1]。然而，肺移植后的存活率仍然低于其他實體器官移植，主要是由于肺缺血-再灌注損傷（LIRI）的嚴重影響以及隨之而來的原發性移植物功能障礙[2],[3]。LIRI會引發復雜的代謝和炎癥紊亂[1],[4],[5]。因此，減輕或延緩LIRI的進展對于改善肺移植的結果至關重要。
肺的肺泡區域覆蓋著一層由兩種主要細胞類型組成的連續上皮層：I型（AT1）和II型（AT2）細胞。AT1細胞約占肺泡表面的90-95%，而AT2細胞作為I型細胞的前體，覆蓋約5-10%的肺泡表面[6]。在肺損傷的情況下，肺泡上皮細胞的線粒體功能常常受損，這種損傷會加劇肺泡炎癥并加重急性肺損傷[7]。脂肪酸氧化（FAO）是產生ATP的重要代謝途徑，主要在線粒體中進行，其中脂肪酸被分解為乙酰輔酶A。生成的乙酰輔酶A隨后進入三羧酸（TCA）循環以供能量產生。肺泡上皮細胞嚴重依賴FAO[8]，這一過程的破壞會加重LIRI。
羥基酰基輔酶A脫氫酶（HADH）是FAO中的關鍵酶，它催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）+依賴性的羥基酰基輔酶A向酮酰基輔酶A的轉化，并參與脂肪酸β-氧化的步驟[9]。HADH的缺失導致雄性小鼠的生殖細胞中脂肪酸和凋亡增加[10]，其突變（外顯子4切除）導致大鼠幼崽的線粒體功能受損，進而引發心力衰竭和猝死[11]。這些發現強調了HADH在維持脂肪酸代謝和線粒體完整性方面的關鍵作用，以及HADH的生理表達對于維持這些代謝和生物能量功能的重要性。人類蛋白質圖譜數據庫中的免疫組化圖像顯示，正常肺泡上皮細胞（HPA039588）中HADH表達豐富。在本研究中，我們在Sprague-Dawley（SD）大鼠中建立了LIRI模型，分析了肺組織中的蛋白質表達譜，并觀察到受損肺組織中HADH表達顯著下降（log2FC = -1.01，p < 0.05）。這些發現促使我們進一步研究HADH在LIRI中的作用及其表達下降的潛在機制。
翻譯后修飾（PTMs）調節蛋白質功能，并在代謝與生理和病理過程之間起到關鍵作用[12]。賴氨酸琥珀酰化最初由Zhang等人在2011年發現[13]，被認為在細胞中起重要作用，因為它會引起蛋白質的顯著結構變化。有趣的是，與線粒體功能相關的蛋白質被發現會發生異常的賴氨酸琥珀酰化。例如，過氧化還原蛋白3（PRDX3）的脫琥珀酰化可以緩解肝臟中的IR誘導的線粒體氧化應激[14]。抑制硫氧還蛋白還原酶1（TXNRD1）的琥珀酰化可以防止其通過泛素化途徑的降解，從而減輕IR處理后的心肌細胞中的ROS生成[15]。Park等人鑒定出HADH中的14個琥珀酰化賴氨酸殘基[16]；然而，HADH的琥珀酰化狀態是否與LIRI有關尚不清楚。
在本研究中，我們使用免疫沉淀（IP）結合LC-MS/MS（IP-LC-MS/MS）技術來鑒定肺泡上皮細胞中HADH琥珀酰化的潛在調節因子。將攜帶HADH編碼片段的腺病毒注射到LIRI大鼠體內，以研究HADH的體內功能作用。
動物模型與處理
本研究得到了鄭州大學生命科學倫理審查委員會的批準。從遼寧長盛生物技術有限公司（中國本溪）購買了10周大的雄性Sprague-Dawley大鼠。大鼠通過吸入3%異氟烷麻醉，并用2%異氟烷維持麻醉狀態。插管后，使用HX-101E呼吸機（成都泰盟）進行機械通氣，潮氣量為10 mL/kg。
綜合組學研究確定HADH是LIRI脂質代謝重塑的核心調節因子和診斷生物標志物
對假手術（N=4）和LIRI大鼠的肺組織進行綜合蛋白質組學和代謝組學分析，發現了差異表達的蛋白質（DEPs）和差異表達的代謝物（DEMs），聯合途徑分析顯示TCA循環、脂肪酸延長和降解途徑顯著富集（圖1A）。代謝組學分析進一步確定了與脂肪酸代謝相關的特定DEMs（圖1B）。其中，20個KEGG脂質代謝途徑中的DEPs被定義為特征性
討論
先前已有研究表明，脂質譜的代謝紊亂會引發細胞炎癥和凋亡[24]，并且被認為是多器官I/R損傷的關鍵驅動因素。針對失調的脂質代謝（例如，由花生四烯酸12-脂氧合酶（ALOX12）調節的亞油酸途徑）可以保護肝臟和心臟免受IR誘導的損傷[25],[26]。AT2細胞中線粒體長鏈脂肪酸的β-氧化受損會加劇炎癥
CRediT作者貢獻聲明
Li Wei：撰寫——審閱與編輯、監督、資源管理、項目管理、概念構思。Zhe Jin：研究、數據分析、數據管理。Chengzhi Ding：研究、數據分析、數據管理。Zhijun Han：研究、數據分析。Peng Miao：研究、數據分析。He Guan：研究、數據分析。Jiwei Li：撰寫——審閱與編輯、初稿撰寫、驗證、方法學設計、研究、數據分析、概念構思
倫理聲明
本研究得到了鄭州大學生命科學倫理審查委員會的批準。本研究未涉及人類樣本。
數據獲取
本研究生成和分析的所有數據均可向相應作者索取。
資助
本研究得到了中原人才計劃（224200510023）、河南省離體肺灌注工程研究中心、河南省終末期肺病工程研究中心和河南省肺結節工程研究中心的支持。
利益沖突聲明
? 作者聲明沒有已知的利益沖突或個人關系可能影響本文的研究結果。
