生命的“中心法則”（DNA → RNA → 蛋白質）描繪了遺傳信息傳遞的經典路徑，而糖基化（在蛋白質或脂質上添加糖鏈）則被視為此路徑之外至關重要的“裝飾”，深刻影響著蛋白質折疊、細胞識別與通訊。長久以來，科學界普遍認為糖基化是蛋白質和脂質的“特權”。然而，這一認知在近年被一項顛覆性的發現所打破：RNA，這一遺傳信息的中間信使，竟然也能被糖基化。這種被稱為“糖基化RNA”（glycoRNA）的新型生物分子，將共價連接的復雜聚糖“穿戴”在RNA骨架上，從而挑戰了分子生物學的傳統邊界，并催生了一個連接糖生物學與RNA生物學的前沿交叉領域。

那么，這些“穿著糖衣”的RNA從何而來？它們如何在細胞中被合成和檢測？它們具有怎樣獨特的結構？更重要的是，它們在生命活動中扮演何種角色，是與疾病作斗爭的新線索，還是潛藏的治療靶點？為了系統回答這些問題，研究人員在《Glycoscience》上發表了題為“Beyond the genome: GlycoRNAs as a nexus of glycobiology and RNA biology”的綜述文章，對糖基化RNA的研究進展進行了全面梳理與展望。

為了深入研究糖基化RNA，研究人員發展并運用了一系列關鍵技術與方法。早期研究主要依賴于代謝標記與點擊化學，即讓細胞攝入帶有化學標記（如疊氮）的糖前體，將其摻入新合成的糖基化RNA，再通過特異性化學反應連接報告分子進行檢測。為了更精準地富集，后續開發了SPCgRNA（固相捕獲N-糖基化RNA）和TnORNA（靶向Tn抗原的O-糖基化RNA）等化學酶法富集技術，其核心是利用半乳糖氧化酶氧化糖鏈末端的半乳糖或GalNAc，生成活性醛基進行固相捕獲。在空間定位與成像方面，出現了ARPLA（適配體與RNA原位雜交介導的鄰近連接檢測）和HieCo 2（分層編碼策略）等方法，實現了在單個細胞或活細胞中原位可視化特定的糖基化RNA。對于更高維度的分析，SUGAR-seq（表面蛋白聚糖與RNA測序）等單細胞多組學技術能夠同時分析同一細胞的轉錄組、表面蛋白和N-聚糖譜。在結構解析層面，rPAL（RNA優化的高碘酸鹽氧化和醛連接）結合SWATH-MS（序貫窗口采集所有理論質譜）質譜技術，揭示了糖鏈與RNA的共價連接位點。此外，研究還利用了來自癌細胞系、患者組織（如結腸癌、胰腺癌）及小鼠疾病模型的樣本進行功能驗證。

最初的研究利用疊氮修飾的唾液酸前體（Ac₄ManNAz）對細胞進行代謝標記，再通過無銅點擊化學連接生物素進行檢測。該方法首次證明了小非編碼RNA（如tRNA、Y RNA）可以攜帶N-聚糖并展示在細胞表面，其聚糖富含唾液酸和巖藻糖，提示其生物合成可能與經典蛋白質糖基化途徑有相似之處。該方法無需預設糖基化RNA的存在，且通過使用不同的疊氮糖類似物可靶向不同類型的聚糖，具有通用性，但缺乏位點特異性分辨率。

為了從總RNA庫中特異性富集糖基化RNA，研究人員開發了基于氧化的方法。SPCgRNA技術利用半乳糖氧化酶氧化糖基化RNA末端半乳糖/GalNAc產生醛基，進而通過固相胺反應捕獲，再經糖苷酶消化釋放，實現了對N-糖基化RNA的高效、高選擇性富集。應用該技術于胰腺癌細胞系，發現了與正常細胞不同的獨特RNA N-糖基化模式。優化后的SPCgRNA通過控制氧化條件和使用辣根過氧化物酶淬滅自由基，減少了RNA降解，成功從人結腸癌及癌旁組織中鑒定出多種N-糖基化小非編碼RNA。類似的，TnORNA方法通過使用O-糖苷酶GalNAcEXO，可特異性富集攜帶Tn抗原的O-糖基化RNA，在胰腺癌中發現了如miR-103a-3p等調控癌癥進展的O-糖基化miRNA。計算工具PONglyRNA的開發則能預測潛在的RNA糖基化位點，輔助實驗驗證。

成像技術為在原生細胞和組織環境中可視化糖基化RNA提供了可能。ARPLA技術聯合使用聚糖結合適配體（如靶向唾液酸）和RNA特異性原位雜交探針，只有當兩者同時結合同一目標分子時才會產生檢測信號，實現了糖基化RNA的高特異性單細胞成像，揭示了其在乳腺癌惡性轉化過程中的動態變化及與脂筏的共定位。HieCo 2策略通過分級DNA編碼和雜交鏈式反應放大信號，能夠在活細胞中原位可視化低豐度RNA（如Y5 RNA）的唾液酸化修飾，并精確定量單個RNA分子上的糖基化位點數。drFRET（雙識別熒光共振能量轉移）策略利用分別識別聚糖和RNA的核酸探針，可對微小細胞外囊泡表面的糖基化RNA進行高靈敏度成像與定量分析，在百人患者隊列中展現出優異的癌癥診斷潛力。

單細胞多組學技術能同時解析同一細胞的多個分子層面。SUGAR-seq技術可同步檢測單個細胞的轉錄組、表面蛋白表位和N-聚糖，成功鑒定了腫瘤浸潤T細胞中具有不同復雜N-聚糖特征的異質性亞群，并將特定的聚糖特征與細胞功能狀態（如衰竭程度）和表觀遺傳特征相關聯。在常染色體顯性骨硬化癥小鼠模型中應用SUGAR-seq，揭示了骨髓細胞中廣泛的N-連接糖基化下調，并發現了與破骨細胞分化異常相關的單核細胞新亞型。

目前，N-糖基化RNA的共價連接位點已被明確鑒定。通過rPAL富集結合質譜分析，證實N-聚糖共價連接在tRNA上經過修飾的尿苷acp³U（3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷）上，該修飾由DTWD酶家族催化生成。遺傳敲除DTWD酶可顯著降低糖基化RNA信號，證實了該結構基礎的關鍵性。相比之下，O-聚糖被認為是糖基化RNA景觀中主要且高度異質性的組成部分，多種證據表明O-聚糖存在于小非編碼RNA上，但其在RNA上的精確核苷酸附著位點尚未解析，也缺乏通用的O-聚糖內切糖苷酶工具，這是該領域的一個重要未解難題。

rPAL方法能特異性標記末端唾液酸，富集天然的唾液酸化糖基化RNA用于質譜鑒定，是解析N-糖基化連接的關鍵工具。為克服其對唾液酸化物種的偏好，glycanDIA（聚糖數據非依賴性采集）等互補方法被用于檢測非唾液酸化聚糖。通過整合多種代謝化學報告分子（靶向唾液酸、GlcNAc、GalNAc、巖藻糖）的研究，在經受嚴格RNase和蛋白酶處理的小RNA組分中仍能檢測到穩定的信號，提示tRNA和snoRNA是主要的糖基化RNA骨架候選。功能研究中，通過差異代謝標記可將單細胞表面的糖基化RNA分為富含唾液酸的glycoRNA-L和富含GalNAc/GlcNAc的glycoRNA-S兩類。

細胞表面展示的糖基化RNA是先天免疫的重要調節者。研究發現，糖基化RNA可作為P-選擇素（SELP）的配體，介導中性粒細胞與內皮細胞的粘附和遷移，從而調節中性粒細胞向炎癥部位的募集，該過程依賴于SID-1同源蛋白。在先天免疫中，糖基化RNA扮演著“雙面角色”：一方面，其糖鏈結構可能作為病原體相關分子模式被識別，觸發免疫反應；另一方面，更關鍵的是，其N-聚糖可對免疫原性RNA基序形成“屏蔽”，防止TLR3、TLR7等先天免疫感受器的異常激活，這是實現免疫逃逸、避免自身免疫的關鍵機制。此外，單細胞表面的glycoRNA-L和glycoRNA-S可通過與內皮細胞上的Siglec-5（唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素-5）結合，促進單核細胞粘附，在炎癥調節中發揮作用。在神經免疫中，神經元表面的糖基化RNA可作為小膠質細胞上Siglec-11的配體，抑制神經炎癥，發揮神經保護作用。

糖基化RNA的表達與癌癥惡性程度相關。利用ARPLA成像技術發現，在乳腺癌細胞系中，細胞表面糖基化RNA的水平與細胞惡性表型和轉移潛能呈負相關。在胰腺癌中，特定的O-糖基化miRNA（如miR-103a-3p）可通過PI3K-Akt通路調控癌細胞生長。糖基化RNA可能通過影響細胞粘附、與腫瘤微環境相互作用以及調節信號通路等方式參與癌癥進展。其異常表達可能成為癌癥的新型生物標志物。

憑借其位于細胞外/囊泡表面的特性和兼具聚糖與RNA的雙重生化特性，糖基化RNA在疾病診斷中展現出巨大前景。drFRET策略對微量生物流體中小細胞外囊泡糖基化RNA的檢測，在區分癌癥與非癌癥、以及癌癥分型中顯示出高準確度。在治療方面，糖基化RNA本身可作為治療靶點。例如，在腹主動脈瘤模型中，研究人員構建了富含糖基化RNA的中性粒細胞膜包被納米顆粒，該顆粒能靶向炎癥部位，通過競爭性抑制中性粒細胞聚集并遞送治療性siRNA，實現了精準治療，展示了以其為基礎構建新型藥物遞送平臺的潛力。

糖基化RNA的發現是糖生物學和RNA生物學領域的革命性進展，它確立了一類新的表觀轉錄組修飾，并提出了與“中心法則”并行的“副中心法則”概念。方法學上，該領域已從初期的代謝標記發展到高選擇性的富集、高分辨率的空間成像及單細胞多組學整合。結構上，N-聚糖與tRNA上acp³U的共價連接已被證實，而O-聚糖構成了其景觀中主要且異質性的部分。功能上，糖基化RNA是免疫和疾病的關鍵調節因子，通過作為P-選擇素、Siglec等受體的配體介導免疫細胞募集與粘附，并通過聚糖“屏蔽”機制在先天免疫中扮演雙重角色。

盡管取得了這些基礎性發現，該領域仍面臨諸多挑戰，包括需要排除糖蛋白信號干擾、開發通用的O-聚糖內切酶、實現低豐度糖基化RNA的超靈敏檢測等。未來研究需優先解析其精確的生物合成與運輸機制，開發正交標記化學和聚糖結構特異性探針，并利用人工智能等先進計算模型解讀其復雜性。鑒于糖基化RNA的異常表達與疾�。ㄈ绨┌Y、心血管疾病、炎癥）密切相關，且位于細胞外，它們極有希望發展成為新一代高精度診斷生物標志物和大分子治療靶點。持續的技術創新與深入的功能研究，對于實現糖基化RNA在革新疾病診療范式、解決腫瘤生物學與免疫互作復雜性方面的潛力至關重要。