《Insect Biochemistry and Molecular Biology》：Molecular and Functional Characterization of
Drosophila melanogaster CYP6A2 in Response to Pesticides and Terpenoids
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果蠅CYP6A2基因在DDT和α-蒎烯脅迫下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與解毒功能研究，通過(guò)RNA干擾模型和生化分析發(fā)現(xiàn)該基因顯著上調(diào)并介導(dǎo)高效解毒，結(jié)合光譜和分子對(duì)接證實(shí)其與兩種化合物的強(qiáng)結(jié)合能力。
Sang-A Lee | Byoungyun Choi | Kyoung Sang Cho | Donghak Kim
韓國(guó)首爾孔敬大學(xué)生物科學(xué)系，郵編05029
摘要
黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的基因組編碼多種細(xì)胞色素P450酶，其中一些酶能夠響應(yīng)外源性物質(zhì)，如殺蟲(chóng)劑和萜類植物化學(xué)物質(zhì)。本研究探討了Cyp6a2基因在暴露于二氯二苯三氯乙烷（DDT）和（?）-α-蒎烯時(shí)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其功能作用。在野生型果蠅中，Cyp6a2基因在DDT處理后表達(dá)顯著上調(diào)，在（?）-α-蒎烯處理后也表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)。為了研究Cyp6a2在解毒中的作用，我們利用Da-GAL4驅(qū)動(dòng)因子生成了一個(gè)依賴GAL4的Cyp6a2 RNAi敲低細(xì)胞系。這些敲低果蠅在接觸這兩種化合物時(shí)存活率顯著降低，表明CYP6A2酶具有保護(hù)作用。此外，在DDT處理過(guò)的敲低果蠅的中腸中檢測(cè)到活性的Death caspase-1（active-Dcp-1），進(jìn)一步支持了這一保護(hù)作用。為了進(jìn)行生化表征，將Cyp6a2基因克隆到pCW載體中，并在大腸桿菌中異源表達(dá)，隨后純化了所得重組蛋白。光譜分析顯示，CYP6A2酶的鐵離子形式主要以低自旋狀態(tài)存在。配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，DDT和（?）-α-蒎烯均表現(xiàn)出典型的I型光譜位移，結(jié)合親和力很強(qiáng)（Kd = 15.8 ± 3.4 μM和18.8 ± 1.3 μM）。分子對(duì)接分析顯示，這兩種配體均結(jié)合在P450酶活性位點(diǎn)的血紅素附近，處于易于氧化的位置。這些結(jié)果有助于我們更好地理解CYP6A2在保護(hù)D. melanogaster免受殺蟲(chóng)劑和植物化學(xué)物質(zhì)引起的環(huán)境壓力方面的生理和生化功能。
引言
細(xì)胞色素P450（P450s或CYPs）是一類含有血紅素的蛋白質(zhì)超家族的成員，在自然界中催化多種生化反應(yīng)（Greule等人，2018；Guengerich，2021；Stavropoulou等人，2018）。它們?cè)诖嬖谝谎趸嫉臈l件下，在450納米處具有獨(dú)特的吸收峰（Guengerich，2021）。P450酶主要催化單加氧反應(yīng)，需要分子氧和來(lái)自NAD(P)H的還原 equivalents（Brignac-Huber等人，2011；Jeong等人，2024；Kim等人，2024）。黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的基因組編碼85個(gè)P450基因（Feyereisen，2006；Lee等人，2023a），這些基因參與內(nèi)源性化合物以及外源性化合物（包括殺蟲(chóng)劑、環(huán)境污染物和植物次生代謝物）的代謝。黑腹果蠅中的幾個(gè)P450基因——例如Cyp302a1、Cyp306a1、Cyp315a1和Cyp307a2——參與蛻皮激素的生物合成，即在昆蟲(chóng)發(fā)育過(guò)程中將蛻皮酮羥基化為20-羥基蛻皮酮（Chung等人，2009；Kannangara等人，2021；Petryk等人，2003）。
昆蟲(chóng)長(zhǎng)期接觸各種天然和合成殺蟲(chóng)劑，從而進(jìn)化出了降解這些化合物的防御機(jī)制。P450酶通常負(fù)責(zé)啟動(dòng)這一解毒過(guò)程。例如，家蠅（Musca domestica）的CYP6A1和CYP12A1已被證明可以氧化多種殺蟲(chóng)劑（如艾氏劑、七氯和狄氏劑）和萜類化合物（Andersen等人，1994；Guzov等人，1998）。在黑腹果蠅中，對(duì)二噁英具有抗性的品系中，Cyp6a2、Cyp6a8和Cyp6w1的表達(dá)水平顯著升高（Morra等人，2010）。特別是Cyp6a2基因與對(duì)二氯二苯三氯乙烷（DDT）的抗性有關(guān)。在抗性品系中發(fā)現(xiàn)了Cyp6a2的點(diǎn)突變，變異的CYP6A2酶表現(xiàn)出更強(qiáng)的將DDT代謝為二氯二苯二氯乙烷（DDD）和二氯二苯乙酸（DDA）的能力（Amichot等人，2004）。在沒(méi)有外源性物質(zhì)暴露的生理?xiàng)l件下，Cyp6a2的表達(dá)水平很低（Giraudo等人，2010），敲低各種Cyp6a基因也不會(huì)導(dǎo)致明顯的發(fā)育缺陷（Neely等人，2010）。因此，Cyp6a2的生理功能仍不清楚。
在本研究中，我們探討了黑腹果蠅（D. melanogaster）在DDT和萜類化合物暴露下Cyp6a2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其功能作用。我們從黑腹果蠅中克隆了Cyp6a2基因，并在大腸桿菌中異源表達(dá)該重組P450酶以進(jìn)行生化分析。我們使用多種萜類化合物和有機(jī)氯殺蟲(chóng)劑（包括蒎烯和DDT）進(jìn)行了配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)。
化學(xué)物質(zhì)和酶
樟腦、3-蒎烯、p-莰烯、（+）-檸檬烯、γ-萜品烯、α-(+)-蒎烯、α-(?)-蒎烯、β-(?)-蒎烯、葡萄糖-6-磷酸、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、二月桂酰-L-磷脂酰膽堿（DLPC）、咪唑和NADP+購(gòu)自Sigma-Aldrich（密蘇里州圣路易斯）。DDT和DDD購(gòu)自Chemservice（賓夕法尼亞州韋斯特切斯特）。Ni2+-硝基三乙酸酯（NTA）瓊脂糖購(gòu)自ThermoFisher Scientific（美國(guó)馬薩諸塞州沃爾瑟姆）。3-[(3-膽酰胺丙基)二甲基氨基]-1-丙烷磺酸（CHAPS）
黑腹果蠅（D. melanogaster）中Cyp6a2基因?qū)DT和（–）-α-蒎烯的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
為了探討Cyp6a2基因在體內(nèi)外源性物質(zhì)代謝中的作用，我們檢測(cè)了其在暴露于DDT后的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。與先前報(bào)道一致，即在DDT抗性黑腹果蠅品系中Cyp6a2表達(dá)升高（Pedra等人，2004；Wan等人，2014），野生型果蠅在暴露于DDT 12小時(shí)后Cyp6a2轉(zhuǎn)錄水平增加了11倍（圖1A）。同樣，暴露于（?）-α-蒎烯12小時(shí)后，Cyp6a2轉(zhuǎn)錄水平也增加了約17倍
討論
在本研究中，我們研究了黑腹果蠅（D. melanogaster）中CYP6A2酶的生化特性和生理作用，以闡明其在解毒外源性化合物（包括合成殺蟲(chóng)劑和植物來(lái)源的萜類化合物）中的作用。我們進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄分析，以確定Cyp6a2基因是否受外源性化合物的誘導(dǎo)。結(jié)果表明，DDT和（?）-α-蒎烯的暴露均顯著上調(diào)了黑腹果蠅（D. melanogaster）中Cyp6a2的表達(dá)
CRediT作者貢獻(xiàn)聲明
Kyoung Sang Cho：撰寫原始稿件、驗(yàn)證數(shù)據(jù)、數(shù)據(jù)管理。
Donghak Kim：撰寫、審稿與編輯、撰寫原始稿件、數(shù)據(jù)可視化、項(xiàng)目監(jiān)督、資金籌集、概念構(gòu)思。
Byoungyun Choi：數(shù)據(jù)可視化、方法設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)研究、數(shù)據(jù)管理。
Sang-A Lee：數(shù)據(jù)可視化、方法設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)研究、數(shù)據(jù)管理
資助
本文得到了韓國(guó)政府資助的NRF項(xiàng)目[RS-2024-00335140]的支持。
利益沖突聲明
作者聲明與本文內(nèi)容無(wú)任何利益沖突。
