《Chemical Engineering Research and Design》：Integrated process design of passage culture and freezing for mesenchymal stem cells toward the establishment of working cell banks
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本研究聚焦再生醫學關鍵細胞源——間充質干細胞（MSCs）工作細胞庫的建立難題。傳統的細胞庫設計依賴于試錯實驗，難以系統優化。為此，研究人員開發了一個集成的工藝模型，將傳代培養與冷凍過程聯系起來，以細胞直徑作為連接參數。該模型能夠評估累積群體倍增水平（cPDL）、解凍后細胞存活率和活細胞數量，從而為優化MSCs工作細胞庫的設計參數提供了高效、可靠的理論工具，有助于推動細胞治療產品的規范化、規模化制備。
在再生醫學的廣闊前景中，間充質干細胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）因其強大的多能分化和免疫調節能力，被視為治療急性移植物抗宿主病、I型糖尿病等多種疾病的希望之星。然而，要將這些“明星細胞”轉化為安全有效的臨床產品，一個穩定、可靠且高質量的細胞來源是基石。細胞庫系統，特別是工作細胞庫（Working Cell Banks），正是這一基石的核心。它如同細胞的“種子庫”，確保了每次生產都能使用經過嚴格質量表征的同一批細胞，避免了每次使用前繁瑣的重復鑒定，并最大限度地減少了細胞因反復傳代導致的衰老和遺傳污染風險。
但建立一個“好”的工作細胞庫并非易事。傳統的建立方法主要依賴大量的試錯實驗，耗時耗力且成本高昂。MSCs在體外擴增（傳代培養）過程中會逐漸衰老，導致細胞變大、增殖能力下降；而在后續的冷凍保存過程中，細胞又會經歷脫水和冰晶形成等物理化學損傷，影響解凍后的活性和功能。這兩個關鍵步驟（傳代和冷凍）相互影響，但以往的研究多聚焦于單一環節的優化，缺乏一個能將兩者打通、從整體上評估和設計工作細胞庫的定量工具。如何科學地預測和平衡傳代次數、培養時間、冷凍速率等參數，以最終獲得解凍后數量充足、活力旺盛的MSCs，是擺在細胞治療產業化面前的一道關鍵工藝難題。
為了攻克這一難題，東京大學化學系統工程系的研究團隊在《Chemical Engineering Research and Design》期刊上發表了一項創新性研究。他們不再將傳代和冷凍視為孤立的單元操作，而是首次開發了一個面向MSCs的“傳代培養-冷凍”集成工藝模型。這個模型巧妙地以“細胞直徑”作為橋梁，將兩個過程串聯起來：在傳代模型中，細胞直徑被表達為累積群體倍增水平（cPDL）的函數，反映了細胞的衰老狀態；在冷凍模型中，則以細胞直徑為輸入，計算解凍后的細胞存活率。給定傳代次數、每代培養天數和冷凍降溫速率，這個集成模型就能一站式地輸出cPDL、細胞存活率和解凍后活細胞數等關鍵質量指標，使得工藝設計者能夠直觀地評估上游傳代策略對下游細胞凍存質量的影響。
研究人員為構建這個集成模型，運用了幾個關鍵的技術方法。首先，基于團隊先前的研究，他們建立了MSCs的傳代培養過程模型，該模型基于Monod方程描述細胞生長，并納入了空間限制、接觸抑制和衰老效應（通過新建立的數據驅動模型量化）等因素。其次，同樣基于先前的凍結機理研究，他們開發了MSCs的冷凍過程模型，該模型包含描述細胞外冰形成的傳熱模型、描述細胞脫水與CPA（Cryoprotective Agent， 冷凍保護劑）滲透的質量傳遞模型，以及描述細胞內冰形成的結晶模型。最后，通過將傳代模型輸出的細胞直徑作為輸入，送入冷凍模型，并利用新的MSCs實驗數據建立了從細胞體積變化和細胞內冰晶體積到細胞存活率的數據驅動關聯模型，從而完成了整個工藝流程的集成。
研究結果
2.1 集成工藝概述
研究明確了集成工藝的設計思路：在傳代過程中，MSCs會衰老并伴隨細胞直徑增大；在冷凍過程中，細胞則經歷脫水和細胞內冰形成。研究選擇“細胞直徑”作為連接這兩個子工藝的關鍵參數。傳代模型基于團隊先前對MSCs的研究構建，其中衰老效應通過新的數據驅動建模進行量化；冷凍模型同樣基于團隊先前的工作，其中細胞存活率通過新的MSCs實驗數據進行數據驅動建模。
2.2 傳代培養過程模型
該模型假設MSCs在培養皿中均勻接種，培養預定時間后進行傳代分割，此操作重復預定次數。細胞生長基于Monod方程計算，并考慮了空間生長限制、接觸抑制和衰老對特定生長率的影響。模型輸入為傳代次數（NP）和每代時間（tP），輸出為細胞總數（Ncell）和細胞直徑（dcell）。研究新建立了衰老函數（fse）和細胞直徑與cPDL的關系式，兩者均通過MSCs實驗數據進行數據驅動擬合得到。
2.3 冷凍過程模型
該模型輸入為細胞直徑（dcell）和冷凍機降溫速率（B），輸出為MSCs存活率（rsurvival）。模型由機理部分（傳熱、傳質、結晶）和數據驅動部分（關聯細胞體積變化、冰晶體積與存活率）組成。傳熱模型用于估算樣品瓶內的溫度分布和固液界面位置；傳質模型描述了由滲透壓差驅動的細胞體積變化以及CPA的跨膜運輸；結晶模型則描述了細胞內冰晶的成核（均相、表面催化、體積催化）與生長機制。最終，通過數據驅動模型，將計算得到的歸一化最大細胞體積變化（ΔV?cellmax）和歸一化最大胞內冰晶體積（V?icemax）與細胞存活率相關聯。
案例研究與模型應用
為了展示所開發模型的應用價值，研究進行了案例研究。在給定一組關于cPDL、細胞存活率和解凍后活細胞數量的約束條件下，模型成功地計算出了MSCs工作細胞庫的可行工藝參數范圍。這表明，該集成模型能夠作為一個有效的計算機輔助工具，用于系統性地設計和優化MSCs從擴增到保存的整個工藝流程，識別出同時滿足多種質量要求的操作窗口。
結論與意義
本研究成功地開發并演示了一個用于MSCs工作細胞庫建立的傳代培養與冷凍集成工藝模型。該模型的核心創新在于通過“細胞直徑”這一生物物理參數，將上游的細胞擴增過程與下游的細胞保存過程有機地聯系起來，實現了對工藝鏈的端到端（End-to-End）定量分析。
其重要意義體現在三個方面：首先，在方法論上，它突破了傳統單一單元操作優化的局限，提供了一個整體的、模型驅動的工藝設計框架，減少了對耗時費力的試錯實驗的依賴。其次，在應用層面上，該模型能夠直接評估傳代培養工藝參數（如傳代次數）對解凍后細胞質量（如存活率）的影響，從而為確定MSCs工作細胞庫的最佳建立方案提供了科學依據和預測工具。最后，該研究為細胞治療產品的制造工藝開發提供了一種可推廣的范式，即通過集成過程建模來理解和優化復雜的生物工藝，這對于推動再生醫學的產業化、標準化和降低成本具有重要的實踐價值。通過這項研究，建立高效、可靠的工作細胞庫從一門“經驗藝術”向一門“定量科學”邁出了關鍵一步。
