《Chinese Medicine and Culture》：Innovative Technologies: Optimizing Nursing Practice
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本研究發現，結合腸道菌群與血清免疫球蛋白G（IgG）亞類（IgG1/IgG2）糖基化特征構建的聯合評分模型，能有效識別代謝功能障礙相關脂肪性肝�。∕ASLD）患者的嚴重肝臟脂肪變性（HS）和顯著肝纖維化，其診斷效能不劣于現有肝脂肪變指數（HSI）和纖維掃描-天冬氨酸氨基轉移酶（FAST）評分，為無創、精準評估MASLD病情進展提供了新思路。
引言
代謝功能障礙相關脂肪性肝病（MASLD）已成為美國肝移植候選者及受者中肝細胞癌（HCC）增長最快的原因。肝活檢是評估肝纖維化的金標準，但具有侵入性、觀察者間差異、采樣誤差等局限。現有非侵入性模型，如肝脂肪變指數（HSI）和纖維掃描-天冬氨酸氨基轉移酶（FAST）評分，雖被廣泛應用，但其依賴的天冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平易受多種治療影響，且纖維掃描操作依賴性強、需要特定設備。因此，迫切需要開發不依賴易變和操作者依賴性工具的新型評估模型。
近期研究強調了腸道菌群與慢性肝病（CLDs）的關系。同時，免疫球蛋白G（IgG）的N-糖基化作為一種翻譯后修飾，在CLDs中受到關注，因為肝臟是糖蛋白合成的主要器官，會導致糖基化模式改變。腸道菌群失調與IgG糖基化改變均在慢性炎癥性疾病的發展中起關鍵作用。本研究旨在利用IgG糖基化特征和微生物聯合體，開發用于識別MASLD患者嚴重HS和顯著肝纖維化的組合模型。
研究方法
本研究為橫斷面研究，招募了2023年5月至2024年10月期間因疑似脂肪肝接受腹部超聲檢查的20歲以上個體。MASLD定義為經組織學或放射學證實的HS，且至少存在一項心臟代謝風險因素。排除標準包括近期接受過免疫調節劑、細胞毒性藥物、化療、類固醇或抗生素治療，以及可能妨礙準確測量的不穩定狀況。
通過瞬時彈性成像（FibroScan）評估HS，受控衰減參數（CAP）值≥292 dB/m表示嚴重HS。通過FIB-4指數評估肝纖維化風險，FIB-4 ≥1.3表示存在顯著肝纖維化的高風險。使用液相色譜/質譜（MS）分析血漿樣品中純化的總IgG及其糖基化特征。糞便樣本通過16S rRNA基因測序分析腸道菌群。
統計分析包括使用微生物豐度差異和IgG糖基化特征比值建立預測嚴重HS和顯著肝纖維化的評分模型，并通過受試者工作特征（ROC）曲線分析評估其分類能力。
結果：腸道菌群特征及其預測模型
研究共納入111名MASLD患者和29名非MASLD個體進行分析。在MASLD患者中，根據CAP水平分層顯示，高CAP組（嚴重HS）的甘油三酯水平顯著升高，白蛋白水平降低。根據FIB-4指數分類顯示，高FIB-4組（顯著纖維化）的天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、糖化血紅蛋白（HbA1c）水平升高，糖尿病患病率更高。
研究發現，與非MASLD個體相比，MASLD患者中有12種細菌的豐度顯著更高。具體而言，在低CAP（非嚴重HS）的MASLD患者中，Eubacterium eligens、Clostridia UCG-014等物種豐度顯著更高，被歸類為非嚴重HS相關細菌。相比之下，Megamonas在高CAP（嚴重HS）的MASLD患者中占主導地位，被歸類為嚴重HS相關細菌。
基于這些細菌的豐度臨界值，通過累加嚴重和非嚴重HS相關細菌的得分，建立了預測嚴重HS的微生物聯合體評分。ROC分析顯示，該評分預測嚴重HS的曲線下面積（AUC）為0.731（敏感性0.855，特異性0.571）。
在肝纖維化方面，Weisella在低FIB-4（非顯著纖維化）患者中占主導，而Christensenellaceae R-7、UCG-005、CAG-56和Lachnospira在高FIB-4（顯著纖維化）患者中更普遍。通過累加非顯著和顯著纖維化相關細菌的得分，建立了預測顯著肝纖維化的微生物聯合體評分，其AUC為0.773（敏感性0.538，特異性0.864）。
結果：IgG亞類糖基化特征及其與菌群的關聯
調整年齡和性別后，MASLD患者中低CAP組與高CAP組之間、低FIB-4組與高FIB-4組之間，部分IgG1和IgG2糖基化特征存在顯著差異。
在低CAP的MASLD患者中，非嚴重HS相關糖基化特征與微生物聯合體（如Lachnospiraceae ND3007和Monoglobus）之間存在5個正相關。相反，Lachnospiraceae ND3007和Monoglobus與嚴重HS相關糖基化特征呈3個負相關。值得注意的是，Megamonas在低CAP組中與嚴重HS相關糖基化特征無關聯，但在高CAP組中與多個特征呈正相關。
在高FIB-4患者中，非顯著纖維化相關細菌Weisella與非顯著纖維化相關糖基化特征IgG2-N4H4F1呈正相關。而在低FIB-4組中未觀察到相關性。這些結果表明，微生物聯合體與糖基化之間復雜的相互作用可能影響HS和顯著肝纖維化的發展。
結果：IgG1與IgG2糖基化特征的相互關聯及預測模型
分析低CAP和高CAP組中IgG1和IgG2糖基化特征間的相互關聯，發現了數個中度至高度的正相關，尤其在非嚴重HS患者中。有三對呈正相關的糖基化特征在低CAP和高CAP組中均保持穩定關聯：IgG1-N4H3F1與IgG2-N4H3F1、IgG1-N4H5F1與IgG2-N4H5F1、以及平分型（bisected）-IgG1與平分型-IgG2。
同樣，在低FIB-4和高FIB-4組中，有四對呈正相關的糖基化特征始終保持穩定關聯：IgG1-N4H3F1與IgG2-N4H3F1、IgG1-N4H5F1與IgG2-N4H5F1、平分型-IgG1與平分型-IgG2、以及IgG1-半乳糖基化指數（Galactosylation Index）與IgG2-半乳糖基化指數。
聚焦于在低CAP和高CAP組中均穩定呈正相關的糖基化特征，評估其比值作為識別嚴重HS的候選指標。結果顯示，IgG2-N4H5F1/IgG1-N4H5F1和平分型-IgG2/平分型-IgG1的比值能夠識別嚴重HS。而IgG2-N4H3F1/IgG1-N4H3F1的比值則不能識別嚴重HS。
類似地，對于識別顯著肝纖維化，穩定呈正相關的特征比值，包括IgG2-N4H3F1/IgG1-N4H3F1、平分型-IgG1/平分型-IgG2和IgG1-半乳糖基化指數/IgG2-半乳糖基化指數，均表現出識別能力。然而，IgG1-N4H5F1/IgG2-N4H5F1的比值不能識別顯著肝纖維化。
結果：結合微生物與糖基化特征的聯合評分模型
為評估微生物聯合體和糖基化特征對識別MASLD患者嚴重HS和顯著肝纖維化的綜合作用，研究者開發了結合微生物評分和糖基化特征比值的聯合評分。
對于識別嚴重HS，若IgG2-N4H5F1/IgG1-N4H5F1或平分型-IgG2/平分型-IgG1的比值超過各自臨界值，則計1分。嚴重HS聯合評分由糖基化特征比值得分與嚴重HS-微生物聯合體評分相加得出。該聯合評分的AUC為0.776，高于肝脂肪變指數（HSI）的AUC（0.645）。
類似地，通過累加顯著肝纖維化-微生物聯合體評分和糖基化特征比值（IgG2-N4H3F1/IgG1-N4H3F1、平分型-IgG1/平分型-IgG2、IgG1-半乳糖基化指數/IgG2-半乳糖基化指數）計算顯著肝纖維化聯合評分。該聯合評分識別顯著肝纖維化的AUC為0.810，高于FAST評分的AUC（0.690）。
除了與現有模型HSI和FAST評分進行交叉驗證外，使用10折自助法（bootstrap）進行的內部驗證也顯示了良好的AUC曲線，校準曲線的Hosmer-Lemeshow檢驗P值分別為0.109和0.797，表明模型擬合良好。
討論
近年研究強調了IgG-GlcNAc相對非半乳糖基化與內臟脂肪沉積之間的關聯，而內臟脂肪沉積又與MASLD患者的HS和纖維化相關。IgG的低半乳糖基化也與兒科MASLD患者的肝臟炎癥有關。本研究發現，MASLD患者中IgG2的低半乳糖基化指數與嚴重HS和顯著肝纖維化顯著相關。值得注意的是，IgG1和IgG2之間特定的糖基化特征比值成為了這些患者嚴重HS和顯著肝纖維化的潛在預測因子。
腸道菌群的改變與MASLD的發病機制有關。腸道細菌Megamonas的豐度增加與MASLD的發展相關，本研究進一步建立了Megamonas與嚴重HS的聯系。先前研究表明Eubacterium和Lachnospiraceae水平降低與HS相關；本研究支持這些物種的豐度隨著HS嚴重程度進展而減少。此外，腸道微生物聯合體的變化與MASLD中肝纖維化的進展相關。我們確定了特定的微生物聯合體以及糖基化特征比值可作為MASLD嚴重程度（特別是嚴重HS和顯著肝纖維化）的潛在預測因子。
本研究中IgG亞類的糖基化特征與嚴重HS和顯著肝纖維化顯著相關。針對糖基化的干預措施已在抗癌療法中進行探索，目前有臨床試驗正在評估其療效。與我們的發現一致，微生物聯合體在各種炎癥條件下影響IgG糖基化。此外，通過糞便微生物群移植改變微生物聯合體，已顯示出通過改變血清N-糖基化模式來減輕慢性炎癥的潛力。因此，通過益生菌改變腸道微生物聯合體來修飾IgG糖基化，可能減輕HS和脂肪性肝炎。
與已建立的預測模型（如HSI和FAST評分）相比，我們的組合模型在預測本隊列中的嚴重HS和顯著肝纖維化方面表現出相當的效能。值得注意的是，HSI和FAST評分中的血清AST水平對肝臟疾病缺乏特異性，并可能受多種因素影響。HSI在區分嚴重脂肪變性方面存在局限，且可能因并發纖維化而產生混淆。此外，FAST評分測量需要纖維掃描等專用設備，操作復雜。相比之下，我們的聯合評分僅依賴于易于獲取的血清和糞便樣本，并可同時檢測嚴重HS和顯著肝纖維化，便于樣本收集和MASLD嚴重程度的綜合評估。
本研究存在一些局限性，主要集中于主要IgG亞類（IgG1和IgG2）的糖基化。未來研究應調查IgG3和IgG4的糖基化以提供更全面的理解。此外，MASLD與非MASLD之間、以及高CAP與低CAP組之間的飲食構成（如熱量、纖維攝入、加工食品等）可能不同，這可能會影響組間腸道菌群的差異。因此，未來研究需要探索飲食構成對組間腸道菌群的影響。盡管纖維掃描存在成本和可及性限制，但糞便微生物群和血清IgG糖基化分析因不同實驗室能力差異和保險適用性，在臨床上也不易獲得。但本研究的初步結果仍可作為進一步肝纖維化藥理學和病理學探索的基礎。
在我們的研究中，與現有模型的交叉驗證、10次內部驗證以及校準曲線均證實了該模型在識別MASLD病例中嚴重HS和顯著肝纖維化的準確性。盡管如此，有限的樣本量阻礙了納入驗證隊列，并且估算的中等效應量為0.65，需要在后續大規模研究中對這些模型進行進一步的外部驗證。盡管存在這些局限性，我們的發現通過校準曲線證實了IgG糖基化特征與MASLD嚴重程度之間存在顯著關聯，強調了糖基化修飾作為一個有前景的治療途徑值得進一步探索。
結論
本研究表明，利用糞便微生物群和血清IgG亞類糖基化特征構建的組合模型具有識別嚴重HS和顯著肝纖維化的潛力，其效能不劣于傳統模型。此外，該研究強調了糖基化修飾作為MASLD一種潛在治療方法的可能性。
