嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）是2019冠狀病毒病（COVID-19）的病原體。重癥COVID-19的一個關鍵特征是過度炎癥狀態，這與呼吸道中單核細胞和巨噬細胞的過度炎癥激活有關。二甲雙胍是一種廣泛使用的抗糖尿病藥物，已被證明可以降低COVID-19患者的死亡率及全身炎癥水平，并且是一種有效的單核細胞和巨噬細胞炎癥激活抑制劑。然而，二甲雙胍免疫調節特性的機制仍存在爭議，其作用主要歸因于對免疫細胞代謝重編程的干擾。二甲雙胍的作用模式與通過阻斷復合體I抑制線粒體呼吸，進而導致三磷酸腺苷（ATP）生成減少并刺激AMP激活的蛋白激酶（AMPK）有關。本研究旨在分離二甲雙胍的主要相互作用（即復合體I抑制和AMPK刺激），并評估它們對SARS-CoV-2刺激引起的炎癥反應的影響，以闡明其在COVID-19中的抗炎機制。

研究招募了17名18至40歲的健康個體，不區分性別或種族。通過免疫磁珠負分選法分離出經典單核細胞（CD14⁺CD16^-），細胞純度高于85%。

所有檢測均使用Seahorse XF基礎培養基進行。細胞在體外用重組刺突蛋白亞基1（rS1）刺激。為評估不同機制，刺激前的單核細胞分別用二甲雙胍、魚藤酮（Rotenone，復合體I抑制劑）、S1QEL（復合體I特異性活性氧清除劑）或A769662（特異性AMPK激活劑）進行預處理。

通過Seahorse細胞外通量分析儀動態監測細胞外酸化率（ECAR）和氧消耗率（OCR），分別量化糖酵解和氧化磷酸化。通過定量聚合酶鏈反應（qPCR）分析炎癥基因表達，包括白介素-1β（IL-1B）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子（TNF）和白介素-10（IL-10），以ACTB作為看家基因進行相對定量。

數據處理和統計分析使用R軟件進行。由于每個個體的單核細胞都接受了所有處理，數據采用配對設計，通過重復測量方差分析或弗里德曼檢驗進行比較，并進行事后檢驗。

與先前研究一致，體外用rS1刺激單核細胞可導致糖酵解反應增強并伴隨促炎細胞因子的產生。二甲雙胍預處理降低了rS1引起的糖酵解反應（），并強烈抑制了線粒體呼吸。在炎癥基因表達方面，二甲雙胍抑制了IL-6的基因表達，并減少了IL-10的表達，但對TNF和IL-1B的表達影響未達到統計學顯著性。這表明二甲雙胍能夠部分抑制由SARS-CoV-2刺突蛋白引發的炎癥和代謝激活。

為了測試二甲雙胍的抗炎作用是否依賴于其對線粒體呼吸鏈復合體I活性的調節，研究使用了復合體I抑制劑魚藤酮。雖然魚藤酮預處理強烈抑制了線粒體呼吸（），但并未改變糖酵解反應，且對細胞因子表達也無顯著影響。這表明，僅抑制復合體I不足以復制二甲雙胍的抗炎效果。

接下來，研究通過使用復合體I超氧化物特異性清除劑S1QEL，來探究抑制復合體I相關的活性氧（ROS）產生是否介導了抗炎作用。結果顯示，S1QEL預處理既未改變糖酵解和線粒體呼吸反應（），也未影響炎癥基因的表達。因此，在rS1刺激的背景下，復合體I相關的ROS產生可能并非炎癥激活的關鍵因素。

鑒于復合體I相關效應未能重現二甲雙胍的作用，研究評估了AMPK激活的作用。用特異性AMPK激活劑A769662預處理單核細胞，能夠抑制rS1誘導的糖酵解反應（），但不影響線粒體呼吸。然而，與單獨使用rS1刺激相比，A769662預處理并未引起炎癥細胞因子基因表達的顯著變化。

盡管AMPK激活未引起細胞因子表達的顯著變化，但其表達模式與二甲雙胍處理相似。通過聚類分析評估各種處理的炎癥譜（IL-1B、IL-6、TNF表達組合）發現，二甲雙胍和A769662處理的細胞與未受刺激的單核細胞聚集在一起，而魚藤酮和S1QEL處理的細胞則與大多數僅用rS1刺激的細胞聚為一類（）。這表明，AMPK激活可能模擬了二甲雙胍引起的部分炎癥反應模式。

盡管已知二甲雙胍具有抗炎特性，但其作用模式，特別是其對AMPK調節的依賴性，仍然存在爭議。一些研究認為其抗炎作用獨立于AMPK活性，主要歸因于抑制線粒體復合體I及相關的ROS生成。然而，在本研究模型中，直接抑制復合體I（魚藤酮）或清除其ROS（S1QEL）均未能改變rS1誘導的免疫代謝激活和炎癥反應，表明該通路可能并非本研究中二甲雙胍作用的主要機制。

AMPK激活被認為是二甲雙胍的主要下游效應之一。AMPK通過限制糖酵解能力和驅動線粒體底物氧化來拮抗代謝性炎癥反應。這與本研究觀察到的二甲雙胍和A769662（AMPK激活劑）均能抑制糖酵解反應的結果一致。本研究中，盡管單獨的AMPK激活未能完全阻止細胞因子的表達，但它產生了與二甲雙胍相似的炎癥譜，提示AMPK調節可能是二甲雙胍在S1刺激下發揮作用的一個核心節點。

值得注意的是，許多相關研究依賴于脂多糖（LPS）誘導的炎癥模型，而刺突蛋白S1介導的激活主要依賴于Toll樣受體2（TLR2）信號，從而引發強烈的核因子κB（NF-κB）反應。此外，S1的炎癥激活高度依賴于通過缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）途徑刺激糖酵解。在這種情況下，二甲雙胍的作用可能通過AMPK/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）軸間接調節該通路。mTOR復合體1（mTORC1）促進炎癥巨噬細胞中HIF-1α驅動的有氧糖酵解，而AMPK抑制其活性并促進抗炎轉變。這一機制與本研究中觀察到的糖酵解抑制相符。

本研究的局限性在于，對炎癥反應的評估僅限于代謝測量和細胞因子基因表達。未評估細胞因子蛋白水平，也未包括ROS的測定。此外，樣本量有限。然而，研究使用了健康的年輕人群，這有助于排除年齡和共病帶來的額外變異，從而進行更好的機制評估。

SARS-CoV-2感染最關鍵的后果之一是局部免疫失衡，導致與高死亡風險相關的過度炎癥狀態。在眾多治療方法中，二甲雙胍最近被證明是超越2型糖尿病控制的、有效的炎癥 attenuator。然而，由于其與多效性代謝樞紐的聯系，精確定義其作用模式具有挑戰性。雖然本研究中單獨測試二甲雙胍的關鍵相互作用點（復合體I抑制、ROS清除、AMPK激活）未能完全復制其抗炎效果，但研究者成功地將AMPK激活識別為一個潛在的核心參與者。進一步研究AMPK在S1刺激的單核細胞中活性的相互作用，可能是一個有潛力的研究方向。