《Frontiers in Veterinary Science》：Dysregulated interferon signaling and hyperinflammation upon FCGBP knockdown in goat bronchial epithelial cells infected with Pasteurella multocida
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本研究揭示了黏膜免疫關鍵蛋白FCGBP在維持山羊呼吸道免疫穩態中的核心作用。通過構建FCGBP敲低的山羊支氣管上皮細胞模型，并聯合感染巴氏桿菌（P. multocida），研究發現FCGBP缺失會破壞細胞屏障功能，并導致感染后I型干擾素、NLR、TNF-α等多個關鍵免疫通路過度激活，引發“細胞因子風暴”。這為深入理解反芻動物呼吸道感染免疫機制和尋找新的干預靶點提供了重要依據。
1 引言
Fc gamma結合蛋白（FCGBP）是一種主要由黏膜上皮細胞分泌的糖蛋白，是黏膜免疫防御的關鍵組分。研究表明，FCGBP能與免疫球蛋白G（IgG）的Fc區結合，并受細胞因子和多種信號通路調控，從而介導免疫反應，在黏膜防御中扮演著至關重要的角色。具體而言，FCGBP通過與三葉因子家族3（TFF3）結合形成功能復合體，共同參與固有免疫。在細菌感染過程中，Toll樣受體（TLR）的激活通過NF-κB通路促進黏液分泌，進而上調FCGBP的分泌。此外，FCGBP基因還能通過NF-κB通路增強IL-6表達，進而激活JAK/STAT3信號級聯反應，進一步調控免疫。也有研究表明，在肺部感染或上皮損傷期間，FCGBP有助于將IgG轉運至黏膜表面，防止細菌系統性入侵。然而，FCGBP在反芻動物呼吸道感染，特別是多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）感染中的功能仍不清楚。
多殺性巴氏桿菌是一種小型、球桿狀的革蘭氏陰性菌，目前主要鑒定出A、B、D、E、F五種莢膜血清型。該病原體可感染多種宿主，包括家禽、野生動物、人類和反芻動物。它能引起山羊的支氣管肺炎和全身性巴氏桿菌病，給畜牧業造成重大經濟損失，并帶來公共衛生風險。山羊尤其易感A和D血清型，其中D型導致更嚴重的病理損傷，主要是出血性敗血癥和肺炎。在分子水平上，巴氏桿菌感染已被證明會上調蛋白HIF-1α和VEGFA的表達，并激活NF-κB信號通路。此外，IFN-γ在加劇由巴氏桿菌相關毒素引起的肺炎中起關鍵作用。先前的研究表明，感染激活了PI3K-Akt和FoxO信號通路，并引發關鍵促炎細胞因子如IFN-γ、IL-12、IL-23和IL-17的顯著增加。
在一項前期的調查中，我們對感染D型巴氏桿菌的山羊肺組織進行了轉錄組測序。對該數據集的進一步分析顯示，感染后肺組織中FCGBP表達上調。然而，在感染該血清型巴氏桿菌期間，FCGBP的具體作用及潛在機制仍不清楚。因此，本研究旨在通過慢病毒介導的技術建立FCGBP敲低模型，并用D型巴氏桿菌在體外感染，以闡明FCGBP缺失對山羊支氣管上皮細胞免疫調節功能的影響。研究重點在于具體評估炎癥細胞因子表達、信號通路激活和抗菌免疫反應的變化。本研究結果闡明了FCGBP驅動細胞對巴氏桿菌感染反應調節的分子基礎，揭示了應對相關呼吸道疾病的新分子靶點。
2 材料與方法
本研究使用了巴氏桿菌D血清型HN01菌株。山羊支氣管上皮細胞在含有6%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的專用培養基中培養。
研究人員構建了兩種靶向FCGBP基因的短發夾RNA（shRNA）慢病毒載體（FCGBP-shRNA-i1 和 FCGBP-shRNA-i2）以及一個陰性對照載體。通過將細胞與攜帶不同shRNA的慢病毒共孵育，建立了FCGBP敲低的細胞模型。通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（GFP）表達和CCK-8細胞活力檢測，確定了最佳感染復數（MOI）為200，且慢病毒轉染未引起顯著細胞毒性。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質印跡法（Western blot）評估，證實FCGBP-shRNA-i2具有更高的敲低效率，因此被選用于后續所有實驗。
為了建立巴氏桿菌感染模型，研究人員用不同MOI（10, 50, 100, 200）的巴氏桿菌感染細胞，并觀察感染后2、4、6小時的細胞形態變化。基于觀察結果，最終選擇MOI 100、感染持續6小時作為后續感染實驗的穩健模型條件。
隨后，研究設置了六組實驗：Ctrl（未處理對照）、CP（巴氏桿菌感染）、NC（陰性對照shRNA轉染）、NCP（陰性對照轉染+感染）、F（FCGBP-shRNA-i2轉染）、FP（FCGBP敲低+感染）。每組設置三個生物學重復。感染后，收集細胞上清用于酶聯免疫吸附試驗（ELISA），細胞則用TRIzol裂解用于RNA提取。
對所有18個樣本進行了RNA測序（RNA-seq）。原始數據經質量控制后，比對到山羊參考基因組，使用DESeq2進行差異表達基因（DEGs）分析。利用OmicShare工具進行主成分分析（PCA）、熱圖生成、以及基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。此外，使用STRING數據庫構建了蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，并在Cytoscape中進行可視化。
通過ELISA試劑盒檢測了關鍵促炎細胞因子（IFN-α、TNF-α、CCL5、IL-17和IL-6）的分泌水平。同時，挑選了ISG15、RSAD2、TRANK1、IFIH1、DDX58、IMP3、RRP9、FADD、PIK3CA和COL1A2等10個樞紐基因，通過qRT-PCR對RNA-seq結果進行了驗證。
3 結果
3.1 慢病毒轉導條件優化與細胞活力
山羊支氣管上皮細胞在明場下呈不規則、鋪路石樣形狀。轉染效率與MOI呈正相關，在MOI 200時觀察到最大熒光效率。CCK-8實驗表明，在轉染后48小時，陰性對照組（NC）和FCGBP敲低組（F）的細胞活力率分別為111%和97%，慢病毒轉染在測試的MOI范圍內未引起顯著的細胞毒性或形態學變化。因此，選擇MOI 200進行所有后續實驗。
3.2 最佳慢病毒干擾片段與敲低效率評估
qRT-PCR分析證實，FCGBP-shRNA-i2的敲低效率優于FCGBP-shRNA-i1。因此，選擇FCGBP-shRNA-i2用于后續實驗。Western blotting分析進一步顯示，與對照組（Ctrl）相比，F2組（FCGBP-i2-shRNA）的FCGBP蛋白表達顯著降低，成功建立了FCGBP穩定敲低的山羊支氣管上皮細胞系。
3.3 巴氏桿菌感染山羊支氣管上皮細胞模型的建立
未感染的對照組細胞在整個觀察期間（6小時）保持不規則的鋪路石樣形狀。在不同MOI（10, 50, 100, 200）感染巴氏桿菌后，所有感染組在感染后2小時（hpi）即可觀察到細胞死亡發生，但無明顯形態變化。到4 hpi時，細胞死亡變得更加明顯。同時，MOI 200組細胞開始呈現輕微的圓形。到6 hpi時，MOI 100和MOI 200組的細胞都表現出明顯的圓形化。基于這些觀察，最終選擇MOI 100、感染持續6小時作為后續CP、NCP和FP組實驗的穩健感染模型。
3.4 RNA-seq數據質量控制分析
原始測序數據經過嚴格質控，有效序列比對到參考基因組的比例超過93%。主成分分析（PCA）顯示，不同實驗組的樣本形成了清晰的聚類。第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）分別解釋了總方差的70.9%和18.1%。Ctrl組和CP組形成了獨立的簇，與NC組和F組以及FP組和NCP組明顯分開。基因表達譜的相關性熱圖進一步支持了這一發現，同一組內的生物學重復高度相關，而Ctrl組和CP組與其他處理組的相關性較低。
3.5 FCGBP敲低放大了感染后的轉錄組變化
差異表達基因分析顯示，FCGBP敲低顯著放大了宿主對感染的反應。單純感染在Ctrl vs. CP比較中誘導了50個DEGs，在NC vs. NCP比較中誘導了695個DEGs。而在FCGBP敲低的細胞中，F vs. FP比較產生了802個DEGs，CP vs. FP比較則產生了最顯著的轉錄改變，共有1,515個DEGs。這表明FCGBP的缺失使細胞在感染時產生了更劇烈、更廣泛的基因表達變化。
3.6 FCGBP調節感染巴氏桿菌的山羊支氣管上皮細胞中的通路和免疫相關DEGs
GO富集分析表明，在感染巴氏桿菌的組中（如Ctrl vs. CP, CP vs. FP），DEGs顯著富集于I型干擾素信號通路和防御反應通路。而在未感染的條件下（Ctrl vs. F），富集的通路主要圍繞細胞組分、細胞器和生物粘附、細胞連接等，表明FCGBP在正常生理條件下的主要功能與維持細胞基本結構完整性相關。有趣的是，在轉錄組水平上，Ctrl vs. F組的IL-6基因表達顯著下調，ELISA結果也證實FCGBP缺失導致基礎IL-6分泌減少。在感染細胞中，CP vs. FP比較的DEGs富集于“細胞表面受體信號傳導”、“對脂多糖的反應”和“對細菌來源分子的反應”，表明FCGBP直接參與了宿主細胞對細菌的感知和防御反應。
KEGG通路分析進一步證實了這些發現。Ctrl vs. CP組的DEGs富集于NLR、TNF和細胞因子-細胞因子受體相互作用等核心炎癥通路。而NC vs. NCP和F vs. FP組的DEGs還額外富集于C型凝集素受體信號通路和FcγR介導的吞噬作用。最重要的是，CP vs. FP組的DEGs表現出最顯著的炎癥特征，高度富集于NLR、TNF、TLR、NF-κB和細胞因子-細胞因子受體相互作用通路。這表明FCGBP缺陷加劇了對巴氏桿菌感染的炎癥反應。
對四個關鍵比較組（Ctrl vs. CP, CP vs. FP, F vs. FP, NC vs. NCP）的DEGs進行重疊分析，發現了28個共同的DEGs。對這些基因進行PPI網絡分析，篩選出前10個樞紐基因，包括ISG15、OAS1、IFIH1、RSAD2、MX1、IFI44、DDX58、RTP4、MX2、XAF1和CMPK2。這些基因在網絡中的中心位置表明它們在宿主對巴氏桿菌感染的反應中起著重要的調控作用。
3.7 PPI網絡識別核心干擾素刺激基因和紊亂的黏附模塊
PPI網絡分析揭示了FCGBP缺陷感染細胞中存在兩個主要的失調模塊。首先，一個干擾素刺激基因（ISGs）核心簇（如ISG15、MX1、RSAD2、OAS1、IFIH1）被過度激活，定量證實了放大的干擾素反應。同時，一個包含細胞黏附和連接完整性所必需的基因模塊（如ITGAE、NGFR、GDNF和AQP2）受到抑制。這些發現表明，FCGBP缺陷可能損害屏障完整性并破壞基本的細胞過程，可能導致感染細胞處于應激和功能失調狀態。
3.8 FCGBP敲低調控細胞因子分泌
通過ELISA對不同處理組分泌的細胞因子IFN-α、TNF-α、CCL5、IL-17和IL-6的濃度進行量化驗證。結果顯示，與各自的未感染對照組相比，CP、NCP和FP組的所有五種細胞因子水平均顯著上調。值得注意的是，FCGBP敲低產生了細胞因子特異性的效應。與CP組相比，FP組的IL-17和CCL5水平顯著降低，而IFN-α濃度則顯著升高。這些蛋白水平的變化與轉錄組譜完全一致。
3.9 qRT-PCR驗證關鍵樞紐基因證實轉錄組數據準確性
通過qRT-PCR對PPI網絡中一致識別的10個樞紐基因的表達水平進行了定量驗證。結果顯示，10個基因中有9個（ISG15、RSAD2、TRANK1、IFIH1、DDX58、IMP3、RRP9、PIK3CA和COL1A2）在RNA-seq和qRT-PCR結果之間表現出高度一致性，證實了測序分析的總體準確性。FADD基因是一個例外，它顯示出不同的表達模式，這種差異可能歸因于轉錄本變體或翻譯后修飾的差異。
4 討論
本研究的結果表明，FCGBP缺陷顯著加劇了巴氏桿菌感染誘導的炎癥反應，并調節了關鍵免疫信號通路的活性。這些發現強調了FCGBP在山羊呼吸道黏膜免疫中的關鍵調節作用。轉錄變化主要出現在特定的抗菌和炎癥通路中，并通過RT-qPCR和ELISA結果得到證實。
為了厘清巴氏桿菌感染的直接影響，分析了Ctrl組和CP組之間的差異基因表達。結果顯示DEGs在I型干擾素信號通路中顯著富集，這與先前的研究報告一致。此外，本模型中觀察到的促炎反應與已發表的體內數據一致。先前的研究表明，感染巴氏桿菌的山羊血清中促炎細胞因子IL-1α、IL-1β和IL-6水平顯著升高，其中IL-6的增加與本研究的ELISA結果尤其一致。轉錄組分析進一步揭示，Ctrl vs. CP組的DEGs顯著富集于多種先天免疫信號通路，包括RIG-I樣受體（RLR）、NLR和TLR通路。NLR是胞質模式識別受體（PRRs），對黏膜免疫防御至關重要，而TLR則感知病原體相關分子模式（PAMPs）。具體而言，TLR識別巴氏桿菌脂多糖可激活先天防御機制，通過下游信號級聯誘導炎癥細胞因子。此外，在CP組而非Ctrl組中，觀察到編碼干擾素誘導的四肽重復序列家族蛋白的基因被顯著誘導。這些基因通常在基礎水平低表達，感染后顯著上調與感知PAMPs相關。對CP組特異性DEGs的PPI網絡分析也支持這一解釋，識別出的樞紐基因包括經典的干擾素刺激基因（ISGs），如ISG15、MX1、MX2和OAS1，以及與I型干擾素信號通路相關的基因。
FCGBP敲低導致感染期間上皮細胞分泌的促炎細胞因子（如IL-6、IFN-α）顯著上調。此外，NCP vs. FP比較的GO富集分析揭示了與細胞外圍和質膜相關的通路，以及肌動蛋白結合和α-輔肌動蛋白結合等分子功能。這一發現支持了FCGBP參與黏膜免疫調節的假說，其主要功能是維持免疫穩態。從機制上講，FCGBP可能通過與其他糖蛋白的相互作用來實現這一點。抑制FCGBP會破壞這種穩態平衡，導致PAMP識別后下游信號通路（如NF-κB）過度激活，從而使宿主易處于失調的過度炎癥狀態。臨床和實驗證據進一步證實了FCGBP的保護作用。例如，有研究報告急性胰腺炎患者的杯狀細胞功能受損（包括FCGBP減少）加劇了結腸中的促炎細胞因子水平，這與本研究敲低模型的結果一致。值得注意的是，在無感染條件下，F組的基礎IL-6水平顯著低于Ctrl組，這與之前的研究結果相符，表明FCGBP在基礎免疫狀態中發揮作用。然而，在病原體感染下，FCGBP的關鍵功能才變得最為明顯。
在FCGBP敲低并隨后感染巴氏桿菌后，FP組表現出比CP組更高的IL-6表達水平。這種增加伴隨著更廣泛、更有效的免疫激活，包括：(1) 干擾素刺激基因（ISGs）的顯著上調；(2) JAK/STAT信號通路參與的證據；(3) 共抑制分子CD274（PD-L1）表達增加。這些證據表明，FCGBP通過NF-κB和JAK/STAT信號通路發揮免疫調節功能，不僅在卵巢，也在肺部。具體而言，FCGBP敲低導致廣泛的免疫相關基因顯著上調，包括炎癥介質、凋亡相關分子、PRR和接頭蛋白、關鍵轉錄因子以及抗原呈遞相關基因。同時，觀察到參與核心細胞功能（如POLR和NOP家族基因）和核糖體生物發生的基因廣泛下調。基因表達從穩態向防御的協同轉變表明，FCGBP敲低徹底重塑了細胞狀態，提高了病原體感知能力，放大了炎癥信號傳導，并增強了免疫效應輸出。
總之，通過整合FCGBP敲低在穩態和感染條件下觀察到的轉錄變化，本研究確定FCGBP是山羊支氣管上皮細胞穩態的核心調節因子。研究數據提供了令人信服的證據，表明FCGBP不僅僅是一個反應元件，更是一個關鍵的主動守護者。它的抑制從內部損害了上皮完整性，這一點從調節細胞黏附和纖毛組裝的關鍵基因（如ITGAE、NGFR、GDNF和AQP2）的下調得到證明。在巴氏桿菌感染后，這種預先受損的上皮屏障和預先致敏的免疫環境共同驅動了過度活躍的病理反應。總體而言，本研究結果確定FCGBP是維持呼吸道上皮免疫穩態的關鍵核心基因，并闡明了其調節氣道免疫的分子機制。這為探索以FCGBP為靶點的策略來治療感染性和炎癥性肺部疾病提供了令人信服的理論基礎。
5 結論
本研究證實，FCGBP在調節山羊支氣管上皮細胞的免疫穩態和細胞屏障方面起著至關重要的作用。FCGBP缺陷破壞了這種調節機制，導致細胞屏障功能受損，以及對巴氏桿菌感染的宿主免疫反應嚴重失調。與Ctrl組相比，F組的DEGs在GO和KEGG分析中富集于“生物粘附”和“細胞連接”通路。此外，CP vs. FP的PPI網絡分析顯示，與細胞黏附相關的ITGAE、NGFR、GDNF和AQP2基因下調，表明FCGBP在維持上皮細胞屏障方面起保護作用。與CP組相比，FP組的DEGs在GO和KEGG通路中富集，包括I型干擾素信號通路、防御反應、細胞表面受體信號通路、對脂多糖的反應以及對細菌來源分子的反應。這些發現表明，在感染巴氏桿菌的細胞中，FCGBP敲低損害了細胞屏障，導致炎癥反應加劇和關鍵免疫通路過度激活。此外，PPI網絡分析揭示，ISG15、MX1、RSAD2、OAS1和IFIH1等關鍵節點基因均與I型干擾素相關，凸顯了I型干擾素通路在FCGBP敲低后抵抗細菌入侵的免疫反應中的關鍵作用。
