《Frontiers in Veterinary Science》：In vitro exposure to polystyrene microplastics exerts oocyte toxicity through cumulus cells damage in the sheep model
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本研究通過體外暴露綿羊卵丘-卵母細胞復合體（COC）于聚苯乙烯微塑料（PS-MP），系統評估了PS-MP對卵母細胞質量與發育潛能的毒性效應及其作用機制。研究發現，PS-MP主要累積于卵丘細胞（CC），通過引發氧化應激、促凋亡基因表達上調（如BAX）及抗氧化防御基因下調（如SOD1, GPX），導致CC凋亡指數顯著升高。CC的功能障礙進一步破壞了與卵母細胞的旁分泌通訊，間接損害卵母細胞，表現為減數分裂恢復受阻、紡錘體與染色體排列異常、胞質活性氧（ROS）水平升高及卵裂率下降。研究表明，CC是PS-MP毒性作用的主要靶點，其受損是介導卵母細胞毒性效應的關鍵環節。
引言：環境污染物與生殖健康新挑戰
當前，環境中廣泛存在的微塑料（MP）已成為全球性健康問題，其對動物和人類生殖功能的潛在風險日益引發關注。其中，聚苯乙烯微塑料（PS-MP）因環境持久性和生物可及性高，成為重點研究對象。在雌性生殖系統中，卵丘-卵母細胞復合體（COC）是卵母細胞發育成熟的功能單位，卵丘細胞（CC）在支持卵母細胞成熟中扮演關鍵角色。本研究以綿羊為模型，探討PS-MP在體外成熟（IVM）過程中對COC的影響，旨在闡明其毒性作用靶點與機制。
材料與方法：系統性的暴露與評估體系
研究采用直徑分別為200 nm（熒光標記，用于攝取評估）和100 nm（非熒光，用于毒性評估）的PS-MP顆粒，設置0、5、50、100 μg/mL四個濃度梯度，在IVM培養基中暴露綿羊COC。實驗設計流程圖系統展示了三大評估模塊：（A）PS-MP在COC及CC單層細胞中的攝取；（B）CC的基因表達與凋亡指數分析；（C）卵母細胞成熟度與發育潛能評估。具體方法包括：通過共聚焦顯微鏡定量熒光強度評估PS-MP攝取；利用實時熒光定量PCR（qPCR）檢測CC中抗氧化（SOD1, CAT, GPX）與凋亡相關（BAX, BCL2）基因的表達；采用TUNEL（末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記）法測定CC凋亡指數；通過染色和共聚焦成像分析卵母細胞的核成熟（生發泡GV、中期IIMII）、胞質質量（線粒體膜電位、活性氧ROS水平、線粒體/ROS共定位）、細胞骨架（紡錘體微管蛋白、皮質F-肌動蛋白）以及通過孤雌激活（PA）和體外胚胎培養（IVEC）評估其發育潛能（卵裂率、囊胚率）。
結果：從細胞攝取到功能損傷的級聯效應
3.1 PS-MP在COC及CC中的特異性攝取與累積
結果顯示，暴露24小時后，僅在最高濃度（100 μg/mL）下，CC內的PS-MP熒光強度顯著高于對照組，而在卵母細胞胞質內未檢測到顯著差異。在CC單層細胞中，PS-MP的生物累積呈現時間依賴性，在5 μg/mL和100 μg/mL濃度下暴露6小時即可觀察到累積，并在24小時后于高濃度組得到確認。這表明PS-MP能夠穿透COC并主要累積于CC中，而卵母細胞本身可能并非直接攝取的主要部位。
3.2 PS-MP誘導CC氧化應激與凋亡
qPCR分析顯示，暴露于100 μg/mL PS-MP的CC中，關鍵抗氧化基因GPX和SOD1的表達水平顯著下調。同時，促凋亡基因BAX在5 μg/mL濃度下即顯著上調。TUNEL檢測進一步證實，PS-MP暴露以劑量依賴的方式顯著增加了CC的凋亡指數（5 μg/mL: 46.6%；50 μg/mL: 64%；100 μg/mL: 81%；對照組: 34%）。這些數據共同表明，PS-MP通過破壞CC的氧化還原平衡并激活凋亡通路，損害了其活力與功能。
3.3 PS-MP損害卵母細胞核成熟與胞質質量
暴露于50和100 μg/mL PS-MP顯著降低了卵母細胞達到MII期的比率，并增加了停滯在GV期的比率，而5 μg/mL濃度無此效應。在達到MII期的卵母細胞中，所有PS-MP暴露組（5, 50, 100 μg/mL）的細胞內ROS水平均顯著升高，表明存在氧化應激。盡管線粒體膜電位未發生顯著變化，但線粒體與ROS的共定位系數在5和50 μg/mL組有所增加。尤為重要的是，細胞骨架受到廣泛破壞：在所有濃度下，具有正常紡錘體形態、染色體正確排列以及規則皮質F-肌動蛋白分布的卵母細胞比例均顯著降低，表明細胞骨架對PS-MP誘導的氧化應激極為敏感。
3.4 PS-MP降低卵母細胞發育潛能
發育能力評估顯示，暴露于50 μg/mL PS-MP的卵母細胞，在PA后24小時的卵裂率顯著低于對照組。然而，在第7天的囊胚形成率、囊胚平均直徑和細胞總數在各處理組與對照組之間均無統計學差異。值得注意的是，僅在對照組中獲得了孵化囊胚。
討論：CC作為毒性樞紐的作用機制
本研究證實，PS-MP在體外暴露下，能選擇性地在綿羊COC的CC中累積，而較少直接進入卵母細胞。CC的損傷表現為抗氧化防御能力削弱（GPX, SOD1下調）和凋亡程序激活（BAX上調，TUNEL陽性率升高）。由于CC與卵母細胞之間存在緊密的代謝與信號交流，CC的功能障礙必然破壞對卵母細胞的支持。這很好地解釋了觀察到的卵母細胞毒性：減數分裂恢復受阻可能源于能量或信號分子供給不足；升高的ROS水平和紊亂的細胞骨架則是氧化應激的直接后果，并可能相互加劇。最終，這些損害影響了胚胎發育的早期事件（卵裂延遲）。研究結果凸顯了CC是環境污染物PS-MP作用于雌性生殖系統的關鍵初級靶點，其受損是介導卵母細胞質量下降的樞紐環節。不同物種、顆粒大小、濃度和研究方法的差異可能導致文獻中部分結論的不一致，提示PS-MP的生殖毒性具有復雜的條件依賴性。
結論
綜上所述，本研究表明，PS-MP體外暴露可通過主要靶向并損傷卵丘細胞，進而間接損害卵母細胞，降低其成熟質量與早期發育潛能。其作用機制涉及氧化應激、細胞凋亡的誘導以及細胞骨架的破壞。這項研究為理解微塑料對大型哺乳動物及潛在人類生殖健康的威脅提供了重要的實驗證據，強調了CC在生殖毒理學中的關鍵作用。未來研究需深入探索其分子通路，并尋找可能的干預策略。
