《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Interkingdom signaling elicited by bacterial extracellular vesicles in human cystic fibrosis airway epithelium and neutrophils
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本文探討了囊性纖維化（Cystic Fibrosis, CF）患者氣道中，宿主與細菌胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）的共存現象及其跨界信號傳導作用。研究聚焦于銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）來源的EVs如何影響CF患者來源的氣道上皮細胞產生EVs的數量與內容物，并改變肺部募集的中性粒細胞（neutrophils）的表型，為理解CF肺部慢性感染與炎癥的機制提供了新視角，提示了通過靶向EVs進行干預的潛在治療策略。
引言：CF氣道中的慢性感染與炎癥難題
囊性纖維化（CF）患者肺部疾病的特征是中性粒細胞驅動的炎癥與細菌感染并存。理解細菌如何在持續存在的中性粒細胞環境下與宿主相互作用、建立慢性感染至關重要，因為持續的炎癥和感染最終導致肺功能喪失和呼吸衰竭。先前的研究表明，從宿主角度看，CF氣道中的中性粒細胞、巨噬細胞和上皮細胞經歷了深刻的功能重編程，導致對細菌的主動宿主耐受狀態。從微生物角度看，包括金黃色葡萄球菌（S. aureus）和銅綠假單胞菌（P. aeruginosa）在內的病原體被選擇并與宿主維持一種準共生關系，在此過程中毒力因子丟失。如何在CF氣道中重新激活細菌清除功能，同時不使宿主更容易受到宿主蛋白酶和氧化酶的肺損傷，或重新激活細菌的毒力途徑，是一個治療挑戰。因此，需要更深入了解細菌與宿主細胞之間的通訊方式。
新興研究揭示了宿主和微生物胞外囊泡（EVs）在調節宿主對微生物挑戰的免疫反應中的作用。EVs存在于所有人體的生物流體中，如血漿、尿液、唾液和氣道液，包括外泌體、微囊泡、胞外體等，大小范圍為50至1,000 nm。人類的生物流體也可能含有微生物EVs，它們與宿主EVs共同進化，執行從誘導細胞遷移到黏膜組織、到細胞間轉移蛋白質、RNA和代謝物等多種功能，從而誘導細胞激活或抑制。先前的研究表明，源自上皮細胞和中性粒細胞的宿主EVs可以促進促炎信號傳導，并有助于CF中的抗菌反應。例如，人類支氣管細胞分泌EVs在調節對P. aeruginosa肺部感染的免疫反應中發揮重要作用。
多個研究小組也顯示了微生物EVs通過病原體相關分子模式（PAMPs）與上皮細胞和巨噬細胞上的模式識別受體（如Toll樣受體，TLRs）結合，從而引發宿主免疫反應的能力。這可以導致促炎細胞因子（特別是IL-8）的分泌，進而驅動中性粒細胞持續募集到CF氣道腔。此外，細菌EVs在調節免疫反應和致病性方面顯示出潛力。例如，靶向EVs中的一種調節RNA可以減少上皮的先天免疫反應。細菌EVs還被證明可以增強生物膜形成，這可能反過來影響EV信號傳導，因為從P. aeruginosaPA14生物膜中分離的EVs與浮游PA14培養物相比，誘導的殺菌反應更低。
本研究旨在證明微生物EVs和宿主EVs在CF氣道液中的共存，并研究前者引發的跨界信號傳導。具體而言，我們展示了P. aeruginosa分泌的EVs在與CF氣道培養物共孵育后，能影響宿主EVs釋放的數量和內容物。此外，我們證明了選擇性改變P. aeruginosaEVs的內容物會影響人氣道上皮細胞的EV釋放和肺部募集的中性粒細胞的激活譜。
方法：研究設計與技術手段
本研究使用了一系列方法探究CF氣道中的EVs。從CF患者（pwCF）的痰液和支氣管肺泡灌洗液（BALF）中分離EVs，并通過納米顆粒追蹤分析（NTA）和基于質譜（MS）的蛋白質組學進行表征。通過支氣管刷檢獲取人氣道上皮細胞，并在氣-液界面（ALI）條件下培養，形成緊密連接和粘液纖毛層。從P. aeruginosa（野生型PAO1及其突變株：外膜孔蛋白F缺失[OprF-]、精氨酸脫氨酶缺失[ADI-]、精氨酸脫羧酶缺失[ADC-]）和S. aureus培養物中分離EVs。將ALI培養物與安全劑量的細菌EVs（0.676 × 108EVs/mL）共孵育24小時后，收集其基底側和頂端側上清液分離EVs。通過NTA、透射電鏡（TEM）和免疫印跡對EVs進行驗證。使用ELISA試劑盒定量細胞因子IL-8。
對于中性粒細胞研究，采用改良的96孔內皮/上皮共培養模型，對從CF供者血液中分離的原代中性粒細胞進行in vitro肺部“條件化”。中性粒細胞在趨化因子白三烯B4（LTB4，陽性對照）、CF氣道上清液（CFASN，病理條件）或不同濃度（1×, 2×, 4×）的P. aeruginosaEVs存在下，進行跨內皮和跨上皮遷移。遷移14小時后，收集中性粒細胞，通過流式細胞術分析表面標志物CD11b、CD16、CD62L、CD63、CD66b的表達。對于蛋白質組學分析，從樣本中分離的EVs經胰蛋白酶消化后，在連接的Evosep One色譜系統的Bruker TimsTOF Pro質譜儀上進行分析。原始數據使用MaxQuant算法，針對智人（Homo sapiens）以及四種常見CF感染原（P. aeruginosa、S. aureus、Haemophilus influenzae、Aspergillus fumigatus）的UniProt/Swiss-Prot數據庫子集進行搜索。通過基因本體（GO）富集分析和ShinyGO工具對鑒定出的蛋白質進行生物信息學分析。
結果1：宿主與微生物EVs共存于CF氣道液
為探究宿主和微生物來源的EVs在pwCF氣道液中的共存，我們從CF氣道液（BALF和痰液）中分離了EVs。基于質譜的蛋白質組學和生物信息學分析顯示，在BALF EVs中，94%的已鑒定蛋白質源自人類宿主，2%源自H. influenzae，2%源自S. aureus，1%源自A. fumigatus，1%源自P. aeruginosa。在痰液EVs中，88%的蛋白質源自人類宿主，1%源自H. influenzae，1%源自S. aureus，1%源自A. fumigatus，9%源自P. aeruginosa。痰液中P. aeruginosa蛋白質比例較高，可能與痰液樣本來自青少年和成人，而16份BALF樣本中有12份來自11歲以下兒童有關。鑒定出的代表性蛋白質包括來自宿主的髓過氧化物酶、中性粒細胞彈性蛋白酶，以及來自P. aeruginosa的III型分泌系統蛋白等。這些數據證實了宿主和微生物EVs在CF氣道液中的共同存在。
結果2：暴露于P. aeruginosaEVs改變pwCF上皮頂端EV濃度
為探究EVs介導的跨界信號傳導，我們將原代人呼吸道上皮細胞暴露于P. aeruginosaEVs，并評估其自身EVs的產生。首先，我們從P. aeruginosa培養物中分離了EVs，并通過NTA和免疫印跡（檢測OprF蛋白）驗證了其特性。建立了來自pwCF和對照供者支氣管刷檢的氣道上皮培養物，在TEER達到約800–1,000 Ω時形成緊密連接，并通過MUC5AC染色確認了粘液纖毛分化。經過劑量反應和MTT細胞活力測試，我們選擇0.676 × 108P. aeruginosaEVs/mL的劑量刺激上皮細胞。暴露后，從頂端和基底側分離上皮來源的EVs。我們觀察到，暴露于P. aeruginosaEVs后，pwCF供者來源的培養物頂端EVs濃度存在患者依賴性的變化，半數供者出現增加。平均而言，暴露后，四名pwCF供者的頂端EVs數量（7.1 × 108顆粒/mL）高于對照供者（3.8 × 108顆粒/mL）。EVs的粒徑分布在暴露前后沒有顯著變化。
接下來，對來自pwCF和對照供者的培養物頂端EVs進行了基于MS的蛋白質組學分析。來自pwCF培養物的EVs鑒定出的蛋白質數量（N=938）高于對照（N=307）。對pwCF供者暴露于P. aeruginosaEVs后產生的頂端EVs蛋白質進行GO富集分析，顯示中性粒細胞介導的過程和囊泡運輸過程顯著富集。熱圖顯示了pwCF與對照供者（暴露于P. aeruginosaEVs前后）培養物中15種上調的頂端EV蛋白質的LFQ強度，包括與CF和白細胞募集相關的蛋白質（如SLPI、ICAM-1）。我們注意到，無論是否暴露，來自pwCF供者培養物的EVs中，幾種參與白細胞反應的蛋白質表達均顯著增加。在pwCF供者培養物中，比較暴露于P. aeruginosaEVs前后的頂端EVs，也觀察到了差異，候選蛋白質包括SS1、精氨琥珀酸合酶和組蛋白H4。
結果3：細菌EVs的蛋白質組學揭示可修飾的信號通路
對從P. aeruginosa和S. aureus菌株分離的EVs進行MS分析。在P. aeruginosaEVs中鑒定出809種蛋白質。GO富集分析顯示，P. aeruginosaEV蛋白質組中代謝過程顯著富集，精氨酸和組氨酸代謝途徑尤為突出。相比之下，在S. aureusEVs中鑒定出的蛋白質數量較少（95種）。鑒于P. aeruginosa在CF痰液樣本中的流行率以及其在EVs中鑒定出的更多蛋白質靶點，后續功能分析更深入聚焦于P. aeruginosa。
接下來，我們測試了來自P. aeruginosa突變菌株（OprF-、ADI-、ADC-）的EVs對上皮細胞的影響。通過NTA評估了暴露于野生型、OprF-、ADI-、ADC-菌株EVs前后，原代CF上皮培養物（源自CF兒童刷檢）頂端和基底側上皮EVs的分泌。暴露于ADI-菌株的EVs后，觀察到上皮EVs分泌減少。此外，通過ELISA分析了在上述條件下CF上皮培養物的IL-8分泌，與野生型相比，暴露于P. aeruginosa突變菌株（特別是OprF-）EVs后，IL-8分泌顯著降低。在使用成人CF細胞模型重復這些實驗時，也觀察到了類似的趨勢，尤其是在暴露于P. aeruginosaEVs后的IL-8水平方面。
結果4：暴露于P. aeruginosaEVs影響肺部中性粒細胞的活化
在模擬人氣道炎癥的生物仿生模型中，進一步評估了從野生型和突變型P. aeruginosa菌株培養物中分離的EVs對肺部中性粒細胞“條件化”的影響。從pwCF血液中純化的初始中性粒細胞，在各種條件下跨越多重內皮（HUVEC）和上皮（H441）屏障進行遷移。遷移條件涉及上皮層頂端的特定環境：CF氣道液（CFASN，病理環境）、白三烯B4（LTB4，趨化因子對照）、僅培養基、以及P. aeruginosaEVs（實驗條件）。考慮到CF痰液中EVs濃度可達1010/mL，其中約10%（109/mL）來自P. aeruginosa，而活中性粒細胞在CF痰液中可達5 × 106/mL，我們評估了肺部募集的中性粒細胞在三種不同劑量的P. aeruginosaEVs（1×, 2×, 4×）暴露下的情況。
所有條件在促進中性粒細胞遷移方面效果相似，CD62L水平無差異。與LTB4趨化因子對照相比，包括P. aeruginosaEVs在內的多種條件下，中性粒細胞活化明顯，表現為CD11b、CD63和CD66b水平升高，CD16丟失，這些效應與CFASN病理環境觀察到的效果相似。這種活化在2×和4×劑量下比在1×劑量下更明顯，并且源自突變菌株（特別是OprF-和ADI-）的EVs比野生型PAO1引起的變化更顯著。這些變化共同表明了CD16的大量脫落和所有顆粒（三級、二級和初級）的脫顆粒，讓人聯想到暴露于CF氣道液所產生的效應。
討論：EVs介導的跨界對話與治療啟示
本研究初步探索了CF氣道液中細菌EVs的存在，并深入研究了常見CF微生物P. aeruginosa的EVs引發人氣道上皮細胞和肺部募集中性粒細胞反應的能力。首先，利用基于MS的蛋白質組學分析和針對人類及微生物物種數據庫的計算查詢，我們證實了宿主和微生物EVs在CF患者的BALF和痰液中確實共存。約90%的EV蛋白質來自人類，約10%來自微生物源。痰液中P. aeruginosaEV蛋白質的比例高于BALF，這可能反映了前者供者年齡較大，與CF中P. aeruginosa感染率隨年齡增加而升高的現象一致。在青少年和成人CF患者的痰液中鑒定出了涉及多藥耐藥和毒力的P. aeruginosaEV蛋白，表明微生物EV蛋白有潛力作為感染的生物標志物。
在確認共存后，我們發現P. aeruginosaEVs會影響患者來源的上皮培養物的EV釋放。暴露于P. aeruginosaEVs后，來自pwCF的氣道上皮培養物頂端EVs濃度發生變化，平均數量高于對照。暴露后的蛋白質組學分析顯示，來自pwCF的刺激氣道上皮培養物的頂端EVs中，典型的中性粒細胞激活分子（如ICAM-1）以及組蛋白H4富集。此外，宿主精氨酸途徑中的一種生物合成酶——精氨琥珀酸合酶在暴露后上調，這提示微生物可能通過EVs干擾宿主精氨酸代謝來調節免疫反應，支持了EVs跨“界”傳遞信號的觀點。
對P. aeruginosaEVs的蛋白質組學分析突出了其中的代謝蛋白、精氨酸途徑介質、已知毒力因子和粘附蛋白（如OprF）。利用PAO1突變庫，我們研究了暴露于野生型和三種特定突變株（OprF-、ADI-、ADC-）EVs對人氣道上皮細胞EVs和細胞因子分泌的影響。在源自CF兒童的上皮培養物中，暴露于ADI-和ADC-菌株的EVs后，頂端EVs和IL-8的分泌減少。暴露于OprF-菌株EVs后，IL-8分泌顯著降低，但上皮EV釋放未受類似影響，這表明P. aeruginosaEVs中包裝的某些蛋白質可能通過經典途徑（如NF-κB/IL-8）影響宿主免疫，而對EV分泌影響相對較小。
重要的是，在我們模擬人氣道炎癥的模型中，暴露于生理相關濃度的P. aeruginosaEVs后，也觀察到肺部條件化中性粒細胞表面特征的顯著變化。特別是觀察到CD16的顯著丟失以及CD11b、CD66b和CD63的上調，這共同表明了CD16的大量脫落和所有顆粒的脫顆粒。這些效應與暴露于CF氣道液的效果相似。此外，暴露于突變菌株（尤其是OprF-和ADI-）EVs引起的中性粒細胞活化效應與野生型P. aeruginosa存在明顯差異。
綜上所述，本概念驗證研究表明，CF氣道中通過EVs存在宿主-細菌相互作用。細菌EVs影響宿主上皮EVs的釋放和中性粒細胞的活化表型。改變細菌EVs的內容物（例如通過基因突變）可以調節這些宿主反應。這為理解CF肺部持續的感染-炎癥循環提供了新的機制視角，并提示靶向EVs介導的跨界信號傳導可能成為未來CF治療的新策略。當然，本研究也存在局限性，例如MS蛋白質組學無法區分EVs膜表面附著蛋白與腔內蛋白，患者樣本量有限且存在個體差異等。但這些初步發現和通過組學識別的新靶點，為未來更深入的機制研究和潛在治療干預開辟了道路。
