特發性肺纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF)是一種慢性、進行性且常致命的間質性肺病，其特征是持續的肺泡損傷、炎癥和細胞外基質重塑，最終導致呼吸衰竭。盡管研究不斷深入，但目前IPF的治療選擇仍然有限，凸顯了對新治療策略的迫切需求。本研究旨在探究中藥玉竹(Polygonatum odoratum, PO)治療IPF的藥理機制。我們采用加權基因共表達網絡分析(Weighted Gene Coexpression Network Analysis, WGCNA)和網絡藥理學方法來識別潛在的治療靶點。通過分子對接和分子動力學模擬評估了關鍵生物活性化合物的結合親和力與結構穩定性。隨后，利用博來霉素誘導的肺纖維化細胞模型進行了實驗驗證。網絡分析確定了中心碳代謝和PI3K-Akt信號通路為關鍵關聯通路。分子對接結果表明，玉竹的生物活性化合物（包括MOL010412和MOL000332）與EGFR、BCL2、MTOR、HIF1A和GSK3B等核心靶點表現出強結合親和力。實驗結果證實，MOL000332（N-香豆酰酪胺）通過抑制EGFR、HIF1A和GSK3B的蛋白表達水平，顯著減輕了肺纖維化。這些發現表明，玉竹通過調節多靶點和多通路發揮其治療作用，使其成為IPF治療的一個有前景的候選藥物。本研究為深入探索和開發基于玉竹的IPF療法提供了堅實的科學基礎。

肺纖維化(Pulmonary Fibrosis, PF)以彌漫性肺泡炎和肺泡結構破壞為特征，是一種由成纖維細胞異常增殖和結締組織過度沉積定義的間質性肺病。慢性炎癥和肺間質的進行性纖維化不可避免地損害氣體交換并導致呼吸困難，造成生活質量顯著下降。PF進展至晚期最終導致呼吸衰竭，嚴重威脅患者生存。作為一種慢性進展性疾病，PF是各種間質性肺病(Interstitial Lung Diseases, ILDs)的終末期結果，并日益被視為一項全球性的重大健康挑戰。多種環境暴露（包括石棉、二氧化硅和煙霧）與氧化應激、線粒體損傷和線粒體自噬相關，特別是在PM_2.5誘導的PF中。此外，一些病毒病原體，如人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)、禽流感病毒和巨細胞病毒(cytomegalovirus, CMV)，已被證明通過病毒感染介導的肺損傷和持續的炎癥浸潤誘發肺纖維化。自身免疫性疾病，如干燥綜合征(sj?gren’s syndrome, SS)和類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)，其特征是免疫失調，可能進一步加速PF進展過程中的炎癥和纖維化重塑。PF大致可分為兩大類：有明確病因的繼發性PF，以及病因未明的特發性肺纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF)。其中，IPF是ILD最常見的形式，被定義為一種無情的進行性且通常是致命的疾病。一旦確診，IPF的中位生存期約為3-5年，并不可阻擋地進展為呼吸衰竭。越來越多的研究證實，表觀遺傳和遺傳異常，連同環境暴露和病毒感染，共同導致了IPF的發病和進展。IPF全基因組測序的初步分析發現了RTEL1和TERT等基因的致病變異，這些變異顯著提高了疾病風險。此外，CD90/Thy-1啟動子的高甲基化已被證明會抑制Thy-1表達，從而促進成纖維細胞-肌成纖維細胞轉化并加劇IPF進展。一項對來自12個地理區域的22項研究進行的薈萃分析估計，IPF的全球發病率為每10萬人1-13例，患病率為每10萬人3-45例。隨著人口老齡化、空氣污染加劇和其他高風險暴露，IPF的全球負擔預計將繼續上升。值得注意的是，IPF與肺癌之間的關聯日益引起臨床關注。臨床解剖學發現證實，IPF中的纖維化通常累及周圍肺和下葉——這些區域也是腫瘤發生的常見部位。總而言之，IPF是一種罕見、不可逆且進行性的纖維化肺病，具有惡性轉化的重大風險，對健康和生活質量構成重大威脅。

IPF治療的臨床試驗正在進行中；然而，現有的治療選擇仍然有限。盡管美國FDA批準的吡非尼酮和尼達尼布可以減緩纖維化進展，但最近的研究報告稱，這些免疫抑制藥物可能產生免疫抑制效應并誘導肝毒性和腎毒性。鑒于這些局限性，為IPF開發有效且更安全的治療策略仍然是肺病學領域的一項重大挑戰。源自藥用植物的生物活性化合物已顯示出有前景的藥理活性，并日益成為抗纖維化藥物發現的焦點。在此基礎上，許多研究探索了天然化合物在PF治療中的潛力，并取得了令人鼓舞的初步發現。例如，源自黃芪(Astragalus membranaceus)的黃芪甲苷(Astragaloside IV, AST)通過抑制RAS/RAF/FoxO信號通路，顯著緩解了慢性阻塞性肺疾病(COPD)中的PF。蒼術醇(Atractylodinol, ATD)是蒼術(Atractylodes lancea)的一種代表性活性成分，被發現通過靶向VIM并下調TGF-β/Smad信號通路來阻止PF進展。此外，雷公藤甲素已顯示出通過調節MMPs/LOX/整合素信號軸來抑制病理性細胞外基質重塑，從而改善PF的潛力。因此，識別具有相當或更優療效且毒性降低的額外的天然植物來源生物活性化合物，可能為改善IPF臨床結果提供有效途徑。在中醫理論中，特發性肺纖維化(IPF)的臨床表現——包括進行性呼吸困難、干咳和疲勞——被歸類為“肺痿”。這個詞最早出現在《金匱要略》中，其核心病機以肺氣陰虧虛、津液輸布受損、肺失濡養為特征，導致肺葉萎縮和功能障礙。久病入絡，導致痰瘀阻滯，最終造成肺部實質性結構損傷。這些描述與現代對IPF的病理理解高度一致，即持續性肺泡上皮損傷、異常修復、細胞外基質過度沉積，以及隨之而來的肺結構重塑和功能下降。

玉竹(Polygonatum odoratum, PO)，又名“葳蕤”，因其食用和藥用價值在中國和韓國備受推崇。作為一種草藥，玉竹在中醫藥中有著悠久的歷史。根據古代典籍《神農本草經》記載，玉竹被描述為性平味甘，歸肺、胃經。它因能生津止渴、養陰潤燥、調和補益而備受推崇，表現出全面的治療功效。沙參麥冬湯是一種經典方劑，包含玉竹、沙參和麥冬，最早記載于《溫病條辨》（清代吳鞠通），至今仍是治療燥傷肺胃的基礎方。現代臨床研究表明，該方可有效改善慢性支氣管炎患者的肺功能，并在作為輔助治療時，提高慢性阻塞性肺疾病急性加重期的療效。此外，對于肺陰虛證型的咳嗽變異性哮喘患者，加減沙參麥冬湯聯合常規西藥治療，其效果顯著優于單純西藥治療。這些臨床觀察為進一步研究玉竹的多靶點藥理機制提供了實踐基礎。更重要的是，現代藥理研究也證實，玉竹的活性成分或提取物具有廣泛的治療效果。玉竹多糖對脂多糖(LPS)誘導的肺部炎癥損傷具有保護作用，這可能與其減少有害細菌和修復腸道屏障的潛力有關。玉竹甲醇提取物通過調節腸道菌群和減輕炎癥來改善潰瘍性結腸炎。此外，包含多糖、高異黃酮和皂苷的玉竹根莖提取物改善了胃部病理損傷，可能是通過抑制氧化應激實現的。盡管取得了這些進展，但關于玉竹及其活性成分治療IPF療效的證據仍然很少。

在IPF的發生和發展過程中，原發性肺損傷（例如感染或有毒顆粒暴露）會引發持續的炎癥反應。這一過程伴隨著明顯的氧化應激，進一步加劇肺泡上皮細胞損傷并誘導成纖維細胞增殖和活化，從而驅動纖維化級聯反應。此外，最近的研究揭示了“腸-肺軸”雙向調節在肺部疾病中的關鍵作用。該軸已被證明參與哮喘和急性肺損傷的調節，并且在肺纖維化中也扮演重要角色。證據表明，肺纖維化小鼠模型表現出顯著的腸道菌群失調和代謝組學特征改變，而通過糞便微生物移植調節腸道微生物生態可顯著改善纖維化結果。在本研究中，我們試圖通過生物信息學分析和體外實驗驗證，探究玉竹緩解IPF的潛在藥理機制。這些發現可能為闡明玉竹對IPF的保護作用提供生物學基礎，并支持其作為臨床上有前景的IPF治療候選藥物的進一步開發。

從GEO數據庫下載與IPF相關的基因表達分析數據GSE53845。該數據集包含40個IPF樣本和8個正常對照肺組織樣本。排除11個IPF肺活檢樣本后，保留了8個正常樣本和29個IPF肺移植樣本用于分析。使用WGCNA包對保留的數據進行標準化和處理，用于聚類分析。此外，還從GEO數據庫獲取了保留數據的相應臨床信息，用于后續分析。

采用WGCNA識別與IPF相關的基因共表達模塊。首先計算所有基因對之間的Pearson相關系數以生成相似性矩陣，然后使用軟閾值化將其轉換為鄰接矩陣。基于此，識別基因模塊。與臨床特征的相關性大于0.5的模塊被認為是顯著的。使用模塊成員度(module membership, MM)和基因顯著性(gene significance, GS)進一步表征模塊與性狀的相關性，將與IPF進展高度相關（相似性大于0.5，p值小于0.05）的模塊識別為顯著模塊。然后導出這些顯著模塊中的基因用于后續分析。為了評估模塊穩定性，使用所有樣本構建了全局共表達網絡。然后使用WGCNA包中的modulePreservation函數評估模塊的保留性，將合并的網絡作為參考，將IPF和對照亞組作為測試網絡。排列檢驗生成Z統計量，量化了模塊結構在亞組間的保留程度。

從傳統中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)檢索玉竹的主要化學成分，共得到62種化學成分。基于口服生物利用度(Oral Bioavailability, OB ≥ 30%)和類藥性(Drug-Likeness, DL ≥ 0.18)的篩選標準，選擇了8種具有潛在藥理活性的成分。隨后，使用Swiss Target Prediction和SEA數據庫預測了這八種活性成分的潛在靶點。整合結果并去除重復條目后，獲得了玉竹的738個潛在治療靶點。

為了探究玉竹活性成分的潛在靶點與IPF相關基因之間的相關性，使用Venny 2.1.0在線工具將WGCNA識別的關鍵模塊基因與玉竹的潛在靶點進行交集分析。隨后生成Venn圖以可視化此交集產生的共同靶點。

利用STRING數據庫探索已知和預測的蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction, PPI)。將玉竹和IPF之間的共同靶點導入STRING數據庫，生物體設置為“Homo sapiens”，并應用默認設置。排除孤立蛋白質以構建共享靶點的PPI網絡。然后將生成的PPI網絡導入Cytoscape 3.9.1軟件，基于節點度生成網絡圖，以進一步識別玉竹治療IPF的核心靶點。此外，利用已識別的玉竹活性成分，在Cytoscape 3.9.1軟件中構建了玉竹治療IPF的“活性成分-核心靶點”網絡。

將玉竹治療IPF的核心靶點提交至DAVID數據庫進行基因本體(Gene Ontology, GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析。這些分析旨在闡明共同靶點在生物過程(biological processes, BP)、分子功能(molecular functions, MF)、細胞組分(cellular components, CC)和相關信號通路中的參與情況。隨后對GO和KEGG富集分析的結果進行了可視化。

關于蛋白質和配體的準備，從RCSB PDB檢索蛋白質結構，并在Discovery Studio 2019中進行處理，包括去除結晶水、共結晶配體、添加氫原子、補充電荷以及修復缺失的側鏈/氨基酸。優化后的蛋白質保存為PDB格式。從小分子配體從PubChem檢索，并在Discovery Studio中使用MMFF94進行能量最小化，然后保存為PDB結構。隨后使用AutoDockTools 1.5.6為受體和配體生成PDBQT文件，包括添加氫原子、分配電荷和定義扭轉。使用AutoDock Vina 1.2.6進行對接，并在PyMOL 3.1和Discovery Studio 2019中進行可視化。

為了進一步評估蛋白質-配體復合物的動態穩定性，使用安裝在本地Linux工作站上的GROMACS 2025進行了分子動力學(molecular dynamics, MD)模擬。將EGFR、HIF1A和GSK3B與N-香豆酰酪胺的對接復合物用作初始結構。使用AMBER14SB力場生成蛋白質拓撲，而使用GAFF2力場構建配體參數，并適當分配原子類型。隨后合并蛋白質和配體的拓撲文件，以確保原子定義的完全兼容性。每個復合物被放置在一個具有周期性邊界條件的立方體模擬盒中，保持任何溶質原子與盒子邊界的最小距離為1.2 nm。使用TIP3P顯式水模型溶劑化系統，并添加Na⁺/Cl^?抗衡離子以中和總電荷并將離子強度調整至0.15 M，模擬生理條件。使用最陡下降法執行能量最小化，直到最大力達到預定義的收斂閾值。然后將最小化的系統在NVT（恒定粒子數、體積和溫度）和NPT（恒定粒子數、壓力和溫度）系綜下平衡2 ns，使用0.1 ps的耦合常數。隨后在310 K恒定溫度和1 bar恒定壓力下進行了100 ns的生產MD模擬。積分時間步長設置為2 fs，每1000步保存一次系統坐標用于下游分析。軌跡分析包括計算均方根偏差(root-mean-square deviation, RMSD)、均方根波動(root-mean-square fluctuation, RMSF)、回轉半徑(radius of gyration, Rg)、溶劑可及表面積(solvent-accessible surface area, SASA)和分子間氫鍵數量，使用內置的GROMACS工具。這些參數用于評估每個復合物在整個模擬過程中的構象穩定性和相互作用持續性。

BEAS-2B細胞培養于補充有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的杜氏改良培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM)中，置于37°C、含5% CO₂的濕潤環境中。當細胞匯合度達到約90%時，使用0.25%胰蛋白酶-,取細胞，隨后以每孔5 × 10³個細胞的密度接種到96孔板中，每個實驗組準備五個復孔。

經過夜孵育以確保細胞充分貼壁后，將培養的細胞暴露于濃度梯度的N-香豆酰酪胺(0、1、10、50、100和200 μg/mL)中處理48小時。N-香豆酰酪胺溶解在二甲基亞砜中，并用培養基稀釋至所需濃度，所有溶液中的最終二甲基亞砜濃度保持在0.05% (v/v)。根據制造商說明書，使用Cell Counting Kit-8 (CCK-8)評估細胞活力。簡言之，每孔加入10 μL CCK-8試劑，隨后在37°C、5% CO₂下孵育2小時。然后使用酶標儀在450 nm波長處測量吸光度(optical density, OD)，以量化N-香豆酰酪胺對細胞活力和增殖的影響。

如上所述進行細胞培養和接種。用10 μg/mL博來霉素處理BEAS-2B細胞48小時以誘導IPF。博來霉素暴露后，用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate-buffered saline, PBS)輕柔洗滌細胞兩次，隨后用50 μg/mL N-香豆酰酪胺處理48小時。使用配備數字成像系統的倒置相差顯微鏡系統觀察并記錄不同組的細胞形態變化。所有觀察和成像均在×100放大倍數下進行。

使用總RNA試劑盒提取總RNA，并使用分光光度計進行定量。使用PrimeScript RT Master Mix從1 μg RNA合成cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq II在QuantStudio 6 Flex系統上進行qPCR，條件如下：95°C 30秒，隨后95°C 5秒和60°C 30秒循環40次。使用2^?ΔΔCT方法將基因表達歸一化至β-肌動蛋白。引物序列如下：HIF1α: F 5′-GTGTACCCTAACTAGCCG-3′, R 5′-ACA AAT CAG CAC CAG C-3′; EGFR: F 5′-CAT CTC CGA AGC CAA CA-3′, R 5′-CGA CGG TCC TCA AAG TAG-3′; GSK3β: F 5′-CAA CTG CCC GAC TAA CAC-3′, R 5′-GAG GAG GAA TAA GGA TGG-3′; β-actin: F 5′-TCA GGG TGA GGA TGC CTC TC-3′, R 5′-CTC GTC GTC GAC AAC GGC T-3′。

用PBS洗滌細胞，并在新鮮添加了1×蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物的RIPA緩沖液中冰上裂解。裂解液在冰上孵育10分鐘，并在4°C下以16,000 × g離心15分鐘。使用BCA法測定蛋白質濃度，將所有樣品歸一化至2 μg/μL以確保等量上樣。隨后，每孔上樣20 μg總蛋白，通過10% SDS-PAGE分離并轉印至PVDF膜。使用蛋白質分子量標記作為參考。膜用含5%脫脂牛奶的TBST封閉，并與以下一抗孵育：HIF1α: Anti-HIF1α; EGFR: Anti-EGFR; Phospho-EGFR: Anti-Phospho-EGFR (Tyr 1173); GSK3B: Anti-GSK3B; Phospho-GSK3B (Ser9): Anti-Phospho-GSK3B (Ser9)。值得注意的是，使用GAPDH作為上樣對照，而不是β-肌動蛋白。這一選擇旨在確保充分的電泳分離，并防止β-肌動蛋白與靶蛋白（GSK3B和p-GSK3B，約46 kDa）之間可能存在的信號重疊，因為它們分子量接近。用TBST洗滌后，膜與HRP偶聯的二抗(1:5000)在室溫下孵育1小時。通過增強化學發光法顯現蛋白條帶，并使用自動ECL成像系統檢測。所有Western blot結果均來自三個獨立的生物學重復，每個重復代表從細胞復蘇和化學處理到蛋白質提取和免疫印跡的完全獨立實驗。

所有數據均表示為平均值±標準差，并使用GraphPad Prism 10.4.1進行分析。通過Shapiro-Wilk檢驗評估數據正態性，通過Levene檢驗評估方差齊性。使用單因素方差分析檢驗多組差異，當總體效應顯著時，隨后進行Bonferroni校正的事后檢驗。只有當校正后的P值低于調整后的閾值時，才認為比較具有統計學顯著性。

加權基因共表達網絡分析是一種識別由高度相關基因組成的基因模塊，并將這些模塊與疾病表型聯系起來以確定與疾病狀態高度相關的核心基因的有效方法。在本研究中，使用包含29個IPF樣本和8個正常樣本的GSE53845數據集進行WGCNA分析。用于質量控制的質量聚類分析結果。為了構建近似無標度拓撲的基因共表達網絡，軟閾值功率β設置為8，這增強了網絡中基因共表達的顯著性和穩定性。隨后的平均連鎖層次聚類分析確定了35個顯著的共表達模塊，其中灰色模塊代表無法分配到其他顯著模塊的基因。

識別與IPF進展高度相關的基因模塊是揭示核心調控靶點的關鍵途徑。通過WGCNA識別了與IPF進展密切相關的基因模塊。與臨床特征的相關系數>0.5且p < 0.05的模塊被認為是顯著的。結果顯示，darkolivegreen模塊、blue模塊、green模塊、greenyellow模塊和saddlebrown模塊與IPF表現出強相關性。此外，IPF臨床樣本的模塊成員度(MM)與基因顯著性(GS)散點圖證實了所選基因模塊與IPF發展之間的顯著相關性。模塊保留性分析表明，blue、green和greenyellow模塊在IPF和對照亞組中高度保留，而darkolivegreen和saddlebrown模塊中度保留，表明跨樣本組的共表達模式穩健。因此，這5個模塊，總計3541個基因，被選擇用于進一步研究。

從傳統中藥系統藥理學數據庫收集了玉竹的生物活性化學成分，共得到62種化學成分。基于口服生物利用度(OB ≥ 30%)和類藥性(DL ≥ 0.18)的篩選標準，選擇了8種具有潛在藥理活性的成分。隨后，使用Swiss Target Prediction和SEA數據庫識別了這八種化學成分的潛在治療靶點。合并結果并去除重復后，獲得了738個玉竹的潛在治療靶點。使用Venny 2.1在線工具確定了IPF相關模塊的核心基因與玉竹潛在靶點之間的交集，得到了137個交集靶點。然后利用這些交集靶點構建了蛋白質-蛋白質相互作用網絡，并在Cytoscape 3.8.2軟件中的進一步分析描繪了玉竹活性成分與IPF相關靶點之間的相互作用。統計分析表明，玉竹的8種活性成分可能潛在地與大部分預測的核心靶點相互作用，暗示了它們對玉竹治療效果的貢獻。

為了闡明已識別交集靶點之間的相互作用，將所有137個靶點上傳到STRING在線平臺，置信度得分閾值≥0.4，以構建初始PPI網絡。排除了孤立的靶點，得到了132個相互作用靶點。剩余的靶點使用Cytoscape 3.8.2和CytoNCA插件進一步分析，以計算度值，度值與網絡靶點節點顏色的強度呈正相關。為了識別玉竹治療IPF的核心靶點，選擇了46個度值高于平均值的靶點構建核心靶點網絡。此外，通過將玉竹的8種活性成分與46個核心靶點在Cytoscape 3.8.2中整合，生成了“活性成分-核心靶點”網絡。生成的網絡表明，這46個核心靶點與8種活性成分顯示出強關聯，并且統計分析確認了與每種成分相關聯的核心靶點數量，表明這些靶點可能代表了玉竹抗IPF治療效果的主要調控節點。

為了研究這些靶點相關的信號通路和生物過程，將核心靶點導入DAVID數據庫進行KEGG通路和GO生物過程富集分析。GO富集在分子功能(MF)上產生了60個條目，在細胞組分(CC)上產生了41個條目，在生物過程(BP)上產生了260個條目。對MF、CC和BP的前20個高頻條目進行了可視化，表明核心靶點主要涉及與蛋白質酪氨酸激酶活性、質膜、磷酸化等相關的GO生物過程。此外，KEGG通路富集分析識別了123條通路。前20條通路的可視化表明，癌癥中的中心碳代謝、PI3K-Akt信號通路等可能代表了玉竹活性成分在緩解IPF中發揮治療效果的關鍵機制。

采用分子對接來驗證活性成分與核心蛋白靶點的直接結合。評估了八種活性化合物與排名前五的核心靶點（度值 >68）之間的結合能，所有化合物都顯示出良好的對接結果，結合能均低于-6.0 kcal/mol。結合能低于-7.0 kcal/mol通常被認為表明配體-受體相互作用的可能性很高。值得注意的是，N-香豆酰酪胺對幾個關鍵靶點表現出強結合親和力，特別是與EGFR (-7.7 kcal/mol)、HIF1A (-7.2 kcal/mol)和GSK3B (-7.8 kcal/mol)。因此，選擇這三個靶點進行進一步的結合模式可視化和分析。對接結果的可視化顯示，N-香豆酰酪胺穩定地占據EGFR、HIF1A和GSK3B的活性位點，并與關鍵氨基酸殘基建立多種穩定相互作用。在EGFR中，配體與ALA-265和GLU-233形成氫鍵和疏水接觸。在HIF1A中，觀察到與TYR-276和SER-274的氫鍵和π-π堆積相互作用。對于GSK3B，N-香豆酰酪胺與包括VAL-135和SER-66在內的殘基建立氫鍵和π-陰離子相互作用。這些相互作用表明在所有三個靶點中都存在穩定且緊密的結合模式。總之，N-香豆酰酪胺與EGFR、HIF1A和