動脈粥樣硬化（Atherosclerosis, AS）是一種累及動脈壁的慢性炎癥性疾病，是全球死亡的主要原因，可導(dǎo)致冠心病、中風(fēng)和外周動脈疾病等多種心血管疾病。其進(jìn)展涉及內(nèi)皮功能障礙、氧化低密度脂蛋白沉積以及包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞在內(nèi)的多種免疫細(xì)胞的復(fù)雜相互作用。這些細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子和趨化因子促進(jìn)斑塊形成和不穩(wěn)定。盡管針對炎癥因子和趨化因子的抑制劑等免疫療法靶點(diǎn)已被確定，但其療效可能取決于動脈粥樣硬化病變內(nèi)免疫細(xì)胞的異質(zhì)性組成和功能狀態(tài)。單細(xì)胞RNA測序技術(shù)為解析這種異質(zhì)性提供了強(qiáng)大工具，然而，中性粒細(xì)胞在病變中的異質(zhì)性及其在疾病進(jìn)展中的作用仍不清楚。

研究整合了來自三個(gè)公開數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)，其中單細(xì)胞RNA測序數(shù)據(jù)集GSE159677包含來自3名接受頸動脈內(nèi)膜切除術(shù)患者的6個(gè)樣本。此外，還使用了兩個(gè)批量微陣列數(shù)據(jù)集GSE28829和GSE43292作為驗(yàn)證集。對單細(xì)胞數(shù)據(jù)，研究使用Seurat包進(jìn)行質(zhì)控、歸一化和降維分析，并應(yīng)用Harmony算法校正批次效應(yīng)。通過UMAP可視化，共鑒定出16個(gè)不同的細(xì)胞亞型。使用CellChat軟件包分析細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)。為了構(gòu)建中性粒細(xì)胞亞型特異性的基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，研究進(jìn)行了高維加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，并利用Lasso回歸篩選特征基因。使用GSE28829數(shù)據(jù)集作為獨(dú)立外部驗(yàn)證集評估了基于四個(gè)特征基因構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型的診斷性能，并通過CIBERSORT算法分析免疫細(xì)胞浸潤情況。通過基因集富集分析和基因集變異分析探究關(guān)鍵基因的生物學(xué)功能和潛在調(diào)控機(jī)制。此外，研究利用RcisTarget包預(yù)測調(diào)控關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄因子，并使用Connectivity Map數(shù)據(jù)庫進(jìn)行藥物預(yù)測。為驗(yàn)證關(guān)鍵基因的表達(dá)，研究分別構(gòu)建了ApoE^?/?小鼠和高脂飲食聯(lián)合維生素D3注射的SD大鼠動脈粥樣硬化模型，并通過實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot、組織染色和磁共振成像等技術(shù)進(jìn)行了體內(nèi)驗(yàn)證。

對47，604個(gè)細(xì)胞進(jìn)行分析后，研究確定了16個(gè)細(xì)胞亞群，注釋為T淋巴細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞等九大類。與配對的鄰近組織相比，動脈粥樣硬化斑塊核心組織中中性粒細(xì)胞的比例顯著增加。對中性粒細(xì)胞亞群的進(jìn)一步細(xì)分顯示，其中多個(gè)亞群在病變組織中比例上升。細(xì)胞通訊分析揭示了這些細(xì)胞亞型之間存在復(fù)雜的配體-受體相互作用對。

通過對中性粒細(xì)胞亞型進(jìn)行hdWGCNA分析，構(gòu)建了基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，鑒定出七個(gè)模塊。其中黑色和黃色模塊的模塊特征基因在動脈粥樣硬化相關(guān)的細(xì)胞亞型中表達(dá)水平顯著升高。從這兩個(gè)模塊中提取排名前25的基因作為候選基因，隨后使用Lasso回歸在訓(xùn)練集GSE43292中進(jìn)行特征篩選，最終確定了四個(gè)核心特征基因：CSTB、CHST15、RNASE1和ATP2B1。

基于這四個(gè)基因構(gòu)建的風(fēng)險(xiǎn)評分模型（RiskScore = CSTB × 0.0122 + CHST15 × 0.0424 + RNASE1 × 0.1121 + ATP2B1 × 0.1297）在訓(xùn)練集和獨(dú)立外部驗(yàn)證集GSE28829中均表現(xiàn)出優(yōu)異的診斷性能，曲線下面積分別達(dá)到0.8721和0.8606。

動物模型實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這些基因在病變組織中的高表達(dá)。在ApoE^?/?小鼠和高脂飲食誘導(dǎo)的SD大鼠動脈粥樣硬化模型中，與對照組相比，病變頸動脈組織中這四個(gè)基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著上調(diào)。

單細(xì)胞數(shù)據(jù)表達(dá)分析顯示，CSTB、CHST15、RNASE1和ATP2B1在多種免疫和血管細(xì)胞類型中均有表達(dá)。免疫浸潤分析表明，與對照組相比，疾病組中M0型巨噬細(xì)胞的比例顯著更高。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，這四個(gè)關(guān)鍵基因與多種免疫細(xì)胞的浸潤水平顯著相關(guān)。例如，CHST15、CSTB和RNASE1的表達(dá)與M0巨噬細(xì)胞呈正相關(guān)，而與CD8 T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。這些基因還與多種免疫抑制因子、免疫刺激因子、趨化因子及其受體的表達(dá)顯著相關(guān)。

基因集富集分析揭示了這些基因參與的關(guān)鍵信號通路。ATP2B1顯著富集于B細(xì)胞受體信號通路、NF-κB信號通路和Toll樣受體信號通路。CHST15顯著富集于抗原加工與呈遞、Fc epsilon RI信號通路和鐵死亡通路。CSTB顯著富集于胞質(zhì)DNA感知通路、IL-17信號通路和Toll樣受體信號通路。RNASE1則顯著富集于脂質(zhì)與動脈粥樣硬化通路、NOD樣受體信號通路和TNF信號通路。

基因集變異分析進(jìn)一步證實(shí)，高表達(dá)這些基因的樣本中，與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激相關(guān)的通路被激活。例如，高表達(dá)CHST15的樣本富集于活性氧通路、IL6 JAK STAT3信號和炎癥反應(yīng)通路；高表達(dá)CSTB的樣本富集于同種異體移植排斥、活性氧通路和炎癥反應(yīng)通路。

轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合motif富集分析發(fā)現(xiàn)，這四個(gè)關(guān)鍵基因的啟動子區(qū)域存在共同的、過度富集的順式調(diào)控基序，提示它們可能受一組特定轉(zhuǎn)錄因子的共同調(diào)控。相關(guān)性分析顯示，關(guān)鍵基因與已知的動脈粥樣硬化調(diào)控基因存在顯著關(guān)聯(lián)，例如CHST15與ALOX5呈顯著正相關(guān)，而CSTB與APOB呈顯著負(fù)相關(guān)。

基于疾病與對照樣本的差異表達(dá)基因譜，通過Connectivity Map數(shù)據(jù)庫進(jìn)行藥物重定位分析，預(yù)測出NU-7441、戈舍瑞林、大觀霉素和MRS-1220等幾種小分子化合物，其表達(dá)譜與疾病特征譜呈顯著負(fù)相關(guān)，提示它們可能具有逆轉(zhuǎn)疾病狀態(tài)的潛力，是潛在的抗動脈粥樣硬化候選藥物。

本研究通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析，在三個(gè)方面為動脈粥樣硬化研究領(lǐng)域做出了貢獻(xiàn)：詳細(xì)描述了病變內(nèi)中性粒細(xì)胞的異質(zhì)性；確定了四個(gè)有潛力的診斷生物標(biāo)志物基因；并初步闡明了疾病進(jìn)展的可能分子通路。研究發(fā)現(xiàn)病變動脈中中性粒細(xì)胞比例升高，這與該細(xì)胞在動脈粥樣硬化發(fā)生中的關(guān)鍵作用一致。所鑒定的CSTB、CHST15、RNASE1和ATP2B1這四個(gè)基因在獨(dú)立隊(duì)列中驗(yàn)證了其診斷價(jià)值。

CSTB編碼的胱抑素B已被提議作為血漿中的心血管疾病生物標(biāo)志物，本研究發(fā)現(xiàn)其與APOB呈負(fù)相關(guān)，提示了其在脂質(zhì)代謝中的新調(diào)控機(jī)制。CHST15與ALOX5的強(qiáng)正相關(guān)，揭示了其在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和鐵死亡中的潛在新軸。RNASE1對維持血管穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，其敲低已被證明可減少動脈粥樣硬化斑塊形成。ATP2B1編碼質(zhì)膜鈣ATP酶1，對維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，其功能異常會影響血管平滑肌細(xì)胞收縮性。

機(jī)制上，這些基因與M0巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞浸潤顯著相關(guān)，并富集于NF-κB、Toll樣受體、IL-17、NOD樣受體、TNF以及鐵死亡等與動脈粥樣硬化病理生理直接相關(guān)的信號通路。藥物預(yù)測結(jié)果為開發(fā)新的療法提供了線索。然而，本研究也存在一些局限性，例如動物模型不能完全模擬人類疾病的復(fù)雜性，診斷模型需要在更大規(guī)模的前瞻性臨床隊(duì)列中進(jìn)一步驗(yàn)證，以及研究主要聚焦于中性粒細(xì)胞，可能忽略了與其他細(xì)胞類型的重要相互作用。

本研究揭示了中性粒細(xì)胞與動脈粥樣硬化進(jìn)展之間的關(guān)聯(lián)，確定了ATP2B1、CHST15、CSTB和RNASE1是這一調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子，并初步探索了相關(guān)的分子通路。這些基因與特定免疫細(xì)胞存在正或負(fù)相關(guān)，可能影響動脈粥樣硬化的免疫微環(huán)境。未來需要在適當(dāng)?shù)哪Ｐ秃颓罢靶耘R床隊(duì)列中開展功能研究，以嚴(yán)格驗(yàn)證這些關(guān)鍵基因作為不穩(wěn)定斑塊診斷標(biāo)志物的作用，并深入探究它們與已知調(diào)控基因相互作用影響疾病進(jìn)展的具體機(jī)制。總之，該研究為動脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊的診斷和治療提供了新的見解，并為探索疾病進(jìn)展的相關(guān)基因和分子機(jī)制提供了新的視角。