通過對GEO數據庫中兩份人腹主動脈單細胞RNA測序數據集（GSE166676與GSE226492）的分析，研究共獲得67,656個細胞（正常組39,782個，AAA組27,874個），并注釋為11種主要細胞類型。與正常組相比，AAA組織中結構性細胞比例顯著降低：成纖維細胞從34.63%降至11.52%，內皮細胞從17.59%降至3.89%，平滑肌細胞（SMCs）從12.95%降至1.66%。相反，免疫細胞如T細胞（從3.84%增至22.35%）、B細胞（從1.92%增至29.59%）和自然殺傷T（NKT）細胞（從2.39%增至7.14%）顯著富集，而巨噬細胞比例變化不大（從13.14%到13.54%）。觀察值與期望值之比（Ro/e）分析進一步顯示，結構性細胞在AAA組中代表性不足，而免疫細胞（T細胞、B細胞、NKT細胞）則顯著傾向于富集在AAA組織中。免疫組織化學（IHC）和免疫熒光（IF）染色在人體主動脈組織中也證實了T細胞和B細胞的富集。這些結果表明AAA組織存在深刻的細胞失衡，其特征是廣泛的免疫細胞浸潤（T細胞和B細胞）和結構性細胞（成纖維細胞、內皮細胞和SMCs）的丟失。

對兩份人腹主動脈瘤批量RNA測序數據集（GSE183464和GSE269845）的分析顯示，AAA與正常組織之間存在顯著的轉錄組異質性。差異表達基因（DEGs）分析發現，上調基因（如CCR7、CXCR4、CD79A）與免疫反應、免疫細胞激活和細胞通訊相關，而下調基因（如ACTC1、COL4A3、ACTN2）則與血管結構和細胞骨架組織相關。兩個數據集中共有589個基因一致上調，449個基因一致下調。基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析表明，上調基因富集于炎癥過程、免疫激活和細胞因子趨化性，而下調基因則與細胞外基質降解和平滑肌收縮相關。基因集富集分析（GSEA）進一步證實，免疫相關通路（如B/T細胞受體信號、細胞因子-細胞因子受體相互作用、趨化因子信號和脂質代謝）在AAA中顯著激活；而與主動脈結構相關的通路（如細胞外基質-受體相互作用、SMC細胞骨架和血管平滑肌收縮）則受到抑制。這些結果證明AAA組織表現出增強的炎癥和免疫反應，并伴有血管壁完整性的破壞。

為識別與AAA進展相關的細胞類型，研究使用Scissor算法分析了批量RNA測序數據。結果顯示，在AAA組中，巨噬細胞含有更高比例的Scissor⁺細胞，而平滑肌細胞（SMC）則含有最高比例的Scissor^-細胞，表明巨噬細胞在AAA發病機制中起關鍵作用。然而，單細胞數據分析和IHC染色顯示，AAA組與正常組之間的巨噬細胞比例并無顯著變化。使用CIBERSORTx對免疫細胞亞群組成的分析發現，在兩個數據集的AAA組中，M2巨噬細胞的比例均顯著降低。單細胞數據集分析顯示，AAA組的M1樣巨噬細胞特征模塊評分上調，而正常組的M2樣巨噬細胞模塊評分更高。此外，AAA組中的巨噬細胞表達升高的M1樣巨噬細胞特征基因，而正常組則表達更高的M2樣巨噬細胞特征基因。免疫熒光染色顯示，健康人主動脈中CD204（MSR1）高表達，而AAA組織中CD86表達水平更高。通過多重免疫熒光染色進一步表征巨噬細胞極化，在人類樣本中，具有促炎M1樣特征的巨噬細胞被鑒定為CD68⁺CD86⁺iNOS⁺，具有抗炎M2樣特征的巨噬細胞被鑒定為CD68⁺CD163⁺CD206⁺。結果顯示，AAA樣本中的巨噬細胞表現出更強的M1樣功能特征，而正常樣本中的巨噬細胞則高表達M2標志物。這些發現表明，雖然巨噬細胞比例變化不大，但M1樣與M2樣巨噬細胞極化之間的失衡可能影響AAA的進展。

對巨噬細胞進行差異表達基因分析發現，與正常組相比，AAA巨噬細胞中有139個基因上調，105個基因下調。GO和KEGG通路富集分析表明，上調基因與生物過程（如趨化性、細胞趨化、免疫和炎癥反應）以及通路（如TNF信號通路、PPAR信號通路、趨化因子信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用通路等）顯著相關。GSEA進一步證實這些過程和通路在AAA組中被激活。在人AAA組織中進行實時定量PCR驗證，結果顯示與免疫反應和趨化相關的基因（IL-1β、IL-8、TNF-α）表達升高。脂質代謝相關標志物（ACC1、FASN、PPAR-γ）的表達水平也升高。油紅O染色也顯示動脈瘤中有明顯的脂質沉積。這些結果表明AAA中的巨噬細胞具有炎癥和脂質積累特征。在細胞因子-細胞因子受體相互作用通路中，IL-1α、CXCL10和CCL20是巨噬細胞中上調最多的三個因子。單細胞數據顯示，CCL20在所有分析的11種細胞類型中主要在巨噬細胞中高表達。免疫熒光共定位進一步證實CCL20主要存在于巨噬細胞中。與正常組相比，CCL20在AAA組織巨噬細胞中的表達顯著升高，這在批量RNA測序數據集中也很明顯。考慮到CCL20的分泌特性及其先前已驗證的診斷效用，研究收集了80名AAA患者和79名健康對照的血清樣本進行酶聯免疫吸附試驗（ELISA）分析。結果顯示，AAA患者的CCL20水平顯著高于健康對照，曲線下面積（AUC）值為0.7。此外，對英國生物樣本庫（UK Biobank）數據的分析顯示，在52,017名參與者中，經過中位13.59年的隨訪，確定了329例AAA事件。多變量Cox回歸結果顯示，循環CCL20水平每增加1個標準差，AAA風險相應增加。與CCL20最低四分位數（Q1）的參與者相比，最高四分位數（Q4）的參與者發生AAA的風險增加了44%。人AAA組織中CCL20的表達也高于正常腹主動脈組織。這些發現表明，CCL20主要由AAA中的巨噬細胞分泌，在組織和血液中水平升高，可能參與AAA的進展。

由于CCR6是CCL20的唯一受體，研究可視化了其在細胞因子-細胞因子受體相互作用通路中的相互作用關系。單細胞數據顯示，CCR6主要在T細胞和B細胞中表達，這一發現在人AAA組織的免疫熒光共定位中得到證實。比較分析顯示，AAA組織中T細胞和B細胞的CCR6表達顯著升高。蛋白質印跡（Western blot）和免疫熒光分析進一步證明人AAA組織中CCR6表達更高。同樣，批量RNA測序數據中CCR6 mRNA水平上調。因此，CCR6在AAA組織中表達升高，主要存在于T細胞和B細胞中。為了探索AAA過程中巨噬細胞介導的潛在趨化因子通訊，研究使用CellChat分析了CCL趨化因子家族。該分析表明，在AAA樣本中，巨噬細胞與多種免疫細胞類型（特別是T細胞、B細胞和NKT細胞）之間富含CCL相關的通訊模式。推斷的CCL20-CCR6相關通訊在AAA組織中主要在巨噬細胞與T細胞、B細胞和NKT細胞之間觀察到。與人組織的免疫熒光分析一致，顯示組間巨噬細胞豐度無顯著差異，但AAA組織中適應性免疫細胞（包括T細胞和B細胞）的浸潤增加。這些觀察結果，連同推斷的通訊模式，表明巨噬細胞源性的CCL20-CCR6信號在AAA病變內的免疫細胞招募中具有潛在作用。為了功能驗證這一假設，研究進行了Transwell共培養實驗，使用脂多糖（LPS）刺激的巨噬細胞和T細胞或B細胞，并在存在CCL20中和抗體的情況下進行。流式細胞術分析顯示，阻斷CCL20-CCR6軸顯著減少了T細胞和B細胞的遷移。這些功能數據共同支持了巨噬細胞源性CCL20-CCR6信號在促進免疫細胞遷移中的作用，為CellChat分析提示的通訊模式提供了實驗驗證。

為了驗證CCL20-CCR6軸在AAA發展中的作用，研究通過輸注血管緊張素II（Ang II）在ApoE^-/-小鼠中建立了AAA模型。通過尾靜脈注射AAV-shCCL20或AAV-shCCR6進行干預。實時定量PCR驗證了主動脈組織中CCL20和CCR6的敲低效率。與對照組相比，AAA組中CCL20和CCR6的表達水平均顯著更高。敲低CCL20或CCR6顯著降低了AAA的發病率。這些發現進一步得到血管多普勒超聲成像和最大主動脈外徑測量的證實。形態學和組學分析表明，破壞CCL20-CCR6軸減輕了主動脈壁的炎癥、彈力蛋白降解和膠原沉積。此外，免疫熒光和免疫組化染色顯示，AAA組織中CCR6表達升高，同時伴有大量的T細胞和B細胞浸潤。相比之下，敲低CCL20或CCR6減少了這些免疫細胞的積聚。通過多重免疫熒光，使用F4/80⁺CD86⁺iNOS⁺作為代表性M1樣標志物，F4/80⁺CD206⁺Arg1⁺作為代表性M2樣標志物，進一步驗證了巨噬細胞極化狀態。實驗結果表明，阻斷CCL20-CCR6軸減弱了促炎M1極化傾向，增強了抗炎M2極化傾向。總之，這些結果表明靶向CCL20-CCR6軸可減少T細胞和B細胞浸潤，并抑制AAA進展。

本研究采用整合的單細胞和批量RNA測序，以及實驗和外部數據驗證，闡明了AAA發病機制的細胞和分子基礎。分析揭示了AAA組織中深刻的免疫細胞浸潤（特別是T細胞和B細胞）和結構性細胞耗竭（成纖維細胞、內皮細胞和SMCs），這是由偏向促炎M1樣巨噬細胞的巨噬細胞極化失衡驅動的。這種失衡促進了CCL20的分泌，從而將表達CCR6的免疫細胞（CCR6⁺T細胞和CCR6⁺B細胞）招募到動脈瘤組織中。ELISA和免疫熒光分析證實了AAA患者血清和組織樣本中CCL20水平顯著升高。通過在AAA中使用CCL20-CCR6軸的敲低模型和CCL20介導的巨噬細胞趨化性的體外中和模型，評估了該軸對AAA的影響。研究結果強調了CCL20-CCR6軸是AAA發病機制的關鍵調節因子和潛在治療靶點。

巨噬細胞浸潤和極化在整個動脈瘤發展過程中演變。M1/M2樣巨噬細胞特征代表了簡化的極化軸，并未涵蓋巨噬細胞異質性的全部譜系；因此，這些結果應被解釋為功能傾向而非離散的巨噬細胞亞型。細胞因子-細胞因子受體相互作用通路在AAA巨噬細胞中高度激活。巨噬細胞極化是AAA的關鍵驅動因素。促炎M1巨噬細胞通過加劇炎癥和分泌細胞因子加速AAA。本研究中，M1樣巨噬細胞極化在AAA巨噬細胞中表現明顯，存在偏向M1樣而非M2樣的失衡。IL-1α、CXCL10和CCL20成為分泌最多的三種趨化因子，其中IL-1α和CXCL10先前已被證實與AAA發病機制相關。本研究聚焦于第三種關鍵趨化因子CCL20及其獨家受體CCR6，以闡明它們在塑造AAA免疫微環境和驅動AAA進展中的具體作用。CCL20-CCR6軸在心血管疾病中調節免疫反應，但其在AAA中的作用仍未充分探索。觀察到M1樣巨噬細胞極化顯著增加了AAA血清和組織中的CCL20表達。與先前研究一致，基于本研究和UK Biobank數據，CCL20可作為大型隊列中AAA的潛在生物標志物。

免疫細胞浸潤長期以來被認為是AAA慢性炎癥進展的基本機制，其中趨化因子起著關鍵作用。與先前發現一致，單細胞分析揭示了AAA組織中深刻的細胞失衡，其特征是廣泛的免疫細胞浸潤（T細胞和B細胞）和結構性細胞（成纖維細胞、內皮細胞和SMCs）的丟失。Ro/e分析進一步證明免疫細胞（T細胞和B細胞）對AAA組織表現出顯著的組織偏好性，表明與動脈瘤進展風險有強關聯。CellChat分析表明，在AAA組中，巨噬細胞在與T細胞、B細胞和NKT細胞的通訊中尤為突出。基于CellChat的通訊分析是推斷性和假設生成性的，未來需要供體感知建模和功能驗證來進一步定義這些信號通路的生物學相關性。

研究提出，活躍的CCL20-CCR6軸為解釋CCR6表達免疫細胞（CCR6⁺T細胞和CCR6⁺B細胞）的特異性招募及隨后的炎癥級聯反應提供了機制框架。T細胞是AAA中的主要免疫細胞群，它們可以促進AAA形成，并在AAA模型中刺激巨噬細胞產生促炎介質如IL-17和TNF-α。IL-17可以刺激SMCs和成纖維細胞分泌基質金屬蛋白酶和包括CCL20在內的促炎細胞因子，從而建立一個正反饋回路，維持持續的淋巴細胞招募。此外，來自其他T細胞亞群的細胞因子，如Th1細胞的IFN-γ，可以協調細胞外基質重塑。同時，浸潤的B細胞通過分泌免疫球蛋白（如IgA和IgG）和細胞因子如IL-6和TNF-α來影響AAA進展，這些物質降解主動脈壁并加劇炎癥反應。清除B細胞可以保護小鼠免受實驗性AAA的影響，并促進免疫抑制的主動脈環境。CCL20-CCR6軸將巨噬細胞激活與CCR6⁺T細胞和CCR6⁺B細胞的靶向招募聯系起來。這些效應細胞的分泌產物反過來作用于血管壁細胞和免疫細胞，加重炎癥反應并加速動脈瘤進展。

抑制趨化因子軸在AAA動物模型中已被證明有效，例如CCL5-CCR5或CCL2-CCR2通路。CCL20-CCR6軸在調節AAA慢性炎癥期間的免疫反應中至關重要，強調了開發靶向該軸的治療策略的必要性。過表達的CCL20促進主動脈彈力蛋白降解，抑制M2極化，并加速AAA，表明其加劇炎癥并驅動進展。在動脈粥樣硬化中，CCR6的缺失有效改善了炎癥進展和斑塊大小。然而，靶向CCL20-CCR6在AAA中的機制和療效尚不清楚。本研究提供了初步證據，表明在該AAA模型中阻斷該軸可降低主動脈直徑、動脈瘤發病率和免疫細胞浸潤。與先前研究一致，AAA模型成功再現了人AAA的關鍵病理特征，包括慢性炎癥和巨噬細胞主導的免疫浸潤。

本研究整合生物信息學分析與實驗驗證，探索AAA發病機制的細胞和分子機制。分析揭示了CCL20分泌的關鍵作用，其由M1樣巨噬細胞極化失衡驅動，招募CCR6⁺免疫細胞（如CCR6⁺T細胞和CCR6⁺B細胞）促進AAA發展。實驗框架已經整合了兩個層次的證據：1）體內遺傳證據（AAV-shCCL20敲低）證明了CCL20在復雜組織微環境中疾病進展的必要性；2）體外藥理學