《Frontiers in Oncology》：The protease inhibitor gabexate mesylate targets Raf kinase inhibitor protein and reverses epithelial–mesenchymal transition in triple-negative breast cancer cells
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本研究揭示了蛋白酶抑制劑加貝酯（GM）通過上調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子RKIP的表達，抑制p42/44 MAPK和NF-κB信號通路及其下游的EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug，從而在三陰性乳腺癌（TNBC）細胞中逆轉(zhuǎn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），降低細胞遷移與侵襲能力。這為針對侵襲性強的TNBC開發(fā)基于EMT的靶向治療策略提供了新的實驗依據(jù)。
RKIP蛋白在三陰性乳腺癌組織中表達缺失
對2009年至2014年間接受象限切除術(shù)或乳房切除術(shù)的10例TNBC患者進行的回顧性分析顯示，所有患者均接受了手術(shù)治療，切緣均為陰性。免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，在所有分析的TNBC組織樣本中，RKIP表達均呈陰性（評分≤1），同時伴隨著E-Cadherin膜陽性降低和腫瘤細胞胞質(zhì)中Vimentin表達增加。與此相反，匹配的正常乳腺組織則顯示出RKIP表達的強胞質(zhì)陽性（評分≥2），與上皮標志物E-Cadherin的高膜表達相關(guān)，而Vimentin染色僅局限于間質(zhì)細胞。這些發(fā)現(xiàn)表明，與匹配的正常乳腺組織相比，RKIP和E-Cadherin在TNBC中顯著下調(diào)，而Vimentin表達上調(diào)。
加貝酯上調(diào)MDA-MB-231細胞中RKIP表達并抑制p44/42 MAPK和NF-κB信號
研究選擇了MDA-MB-231細胞系作為體外TNBC模型。在長達72小時的給藥時間內(nèi)，50 μg/mL的GM劑量未觀察到對細胞活力的影響，因此該治療方案被用于后續(xù)實驗。研究發(fā)現(xiàn)，給予GM 72小時可誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞中RKIP表達顯著增加。由于RKIP是p44/42 MAPK信號通路的生理性內(nèi)源性抑制劑，研究進一步探討了GM對該通路的影響。結(jié)果顯示，GM處理后，該細胞系中磷酸化的MEK-1/2和p44/42 MAPK蛋白顯著減少，證實了該藥物對MAPK信號通路的抑制。鑒于RKIP在NF-κB信號通路調(diào)控中的作用，研究進一步調(diào)查了GM對這一致癌通路的影響。已知在無刺激情況下，IκBα通過與胞質(zhì)中的RelA/p65蛋白形成復(fù)合物來抑制NF-κB信號。當經(jīng)典NF-κB通路被激活時，IκBα發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致其蛋白酶體依賴性降解，RelA-p50二聚體得以進入細胞核，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用。本研究發(fā)現(xiàn)，給予GM可降低磷酸化IκBα蛋白的表達；此外，對處理細胞進行亞細胞分餾顯示，RelA/p65胞質(zhì)蛋白表達水平增加，同時細胞核部分減少。這些發(fā)現(xiàn)表明，GM能上調(diào)RKIP表達，從而抑制MDA-MB-231細胞中的p44/42 MAPK和NF-κB通路。
加貝酯逆轉(zhuǎn)MDA-MB-231細胞中的EMT表型
p44/42 MAPK和NF-κB通路的激活已被報道可誘導(dǎo)某些EMT轉(zhuǎn)錄因子的表達，在上皮細胞特性轉(zhuǎn)錄抑制和間質(zhì)性狀促進中起關(guān)鍵作用。因此，研究探討了GM抑制p44/42 MAPK和NF-κB通路是否與EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug表達降低相關(guān)。報告顯示，用該藥物處理72小時可顯著降低這兩種蛋白的水平。這種降低同時伴隨著上皮標志物E-Cadherin和Claudin-1的表達增加，以及間質(zhì)標志物N-Cadherin和Vimentin的表達減少。在形態(tài)學(xué)水平上，GM處理誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞從細長/成纖維細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦蛴谏掀さ募毎螒B(tài)，提示了間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET）的促進。由于在EMT過程中，細胞黏附分子E-Cadherin的表達減少，削弱了細胞間連接，并導(dǎo)致β-catenin的胞質(zhì)積累和核轉(zhuǎn)位，研究也調(diào)查了GM處理對E-Cadherin和β-catenin細胞定位的影響。通過共聚焦分析，觀察到GM處理的MDA-MB-231細胞中E-Cadherin定位于細胞膜，同時胞質(zhì)和細胞核β-catenin染色均減少，從而證實GM處理可以增強細胞間連接，并促進這些細胞的MET表型。
加貝酯影響MDA-MB-231細胞運動性和侵襲性
最后，研究探討了GM誘導(dǎo)的從EMT到MET的表型轉(zhuǎn)換是否也反映在MDA-MB-231細胞運動性和侵襲潛能的降低上。劃痕實驗表明，與傾向于閉合傷口間隙的對照細胞相比，用GM處理72小時顯著降低了MDA-MB-231細胞的遷移能力。同樣，與對照組相比，經(jīng)GM處理的細胞顯示出降低的侵襲行為。在分子水平上，觀察到GM處理的細胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表達和活性均顯著降低。這些發(fā)現(xiàn)表明，GM能夠逆轉(zhuǎn)EMT表型，并顯著降低TNBC細胞的遷移和侵襲潛能。
討論
TNBC是一組在基因組、轉(zhuǎn)錄組和組織病理學(xué)水平上具有異質(zhì)性的惡性腫瘤。盡管已付出諸多努力來鑒定具有預(yù)后或治療相關(guān)性的假定分子亞組，但其目前的臨床優(yōu)勢仍然相當有限。毫不奇怪，識別單一可操作靶點以及由此產(chǎn)生的生物標志物驅(qū)動療法，仍然是一個未滿足的臨床需求。使用靶向療法，如聚ADP核糖聚合酶（PARP）抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、免疫療法和嵌合抗原受體T細胞療法，很少能代表有價值的治療選擇。相反，目前只有少數(shù)患者可以從某些定制方法中獲益。可以預(yù)見，基于RNA或DNA的下一代測序技術(shù)的不斷進步可能會擴大有資格接受靶向治療策略的患者數(shù)量。然而，在解析腫瘤異質(zhì)性難題方面仍然存在若干障礙，這使得標準化療仍是TNBC治療的基石。在這種背景下，TNBC患者的預(yù)后仍然很差，基本上歸因于疾病快速進展和早期轉(zhuǎn)移累及關(guān)鍵器官。
新興研究表明，TNBC的轉(zhuǎn)移至少部分與癌細胞EMT表型有關(guān)。因此，使用有效的靶向EMT藥物已被提議作為改善TNBC患者臨床結(jié)局的有吸引力的治療方法。就治療意義而言，參與EMT過程協(xié)調(diào)的廣泛信號通路提供了各種潛在的可操作分子靶點。盡管多年來已經(jīng)部署了多類藥物，但幾乎都未通過臨床試驗的基準。因此，針對TNBC中EMT驅(qū)動的腫瘤侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能的藥理學(xué)方法仍然缺乏。迄今為止，只有被批準用于轉(zhuǎn)移性或局部晚期TNBC的非紫杉烷紡錘體抑制劑艾日布林，被證明可有效對抗EMT驅(qū)動的表型。在驅(qū)動TNBC轉(zhuǎn)移的分子改變中，RKIP通路的失調(diào)在多項研究中已顯現(xiàn)。鑒定能夠恢復(fù)RKIP表達的藥物，作為這些患者的潛在治療策略，正獲得越來越多的科學(xué)關(guān)注。
在本研究中，報告了轉(zhuǎn)移抑制基因RKIP在TNBC組織樣本中表達缺失，并與間質(zhì)標志物Vimentin的上調(diào)和上皮標志物E-Cadherin的下調(diào)相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)與已知的TNBC高侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能相符。有趣的是，研究表明，使用臨床可達到血藥濃度的蛋白酶抑制劑GM，能夠在成熟的體外TNBC模型中增加RKIP表達并逆轉(zhuǎn)EMT表型。這種表型變化伴隨著上皮標志物E-Cadherin和Claudin-1的上調(diào)，以及間質(zhì)標志物N-Cadherin、Vimentin和核β-catenin的下調(diào)。此外，GM顯著降低了體外TNBC細胞的運動性和侵襲性，同時降低了MMP-2和MMP-9蛋白的表達和活性，而MMP-2和MMP-9是TNBC的負性預(yù)后因素。在機制層面，RKIP上調(diào)抑制了p42/44 MAPK和NF-κB信號，進而下調(diào)了EMT轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug的表達。
盡管這些初步發(fā)現(xiàn)需要在更具代表性的離體模型（如患者來源的原代細胞或患者來源的類器官）和體內(nèi)TNBC模型中得到證實，但它們提供了證據(jù)，表明EMT過程可以通過蛋白酶抑制劑GM在高度轉(zhuǎn)移的TNBC體外模型中實現(xiàn)藥理學(xué)逆轉(zhuǎn)，值得在未來研究中進一步深入探討。
