《Annals of Hematology》：A novel HBD gene mutation associated with normal-range hb A2 in β-thalassemia carriers
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本研究針對β-地中海貧血攜帶者篩查中因Hb A2水平正常或處于臨界值而可能導致漏診的問題，在一個中國家庭中鑒定出一種新型的HBD基因突變（c.93-21G>A）。研究表明，該突變通過激活隱蔽剪接位點導致內含子保留，產(chǎn)生提前終止密碼子（PTC），進而觸發(fā)無義介導的mRNA降解（NMD），最終降低了Hb A2的合成。這一發(fā)現(xiàn)對改善β-地貧的臨床診斷與遺傳咨詢具有重要意義。
論文解讀
在地中海、東南亞以及中國南方地區(qū)，β-地中海貧血是一種非常常見的單基因遺傳病。在中國南方，其攜帶者頻率高達3-4%。對于這種疾病，預防是關鍵，而預防的第一步就是準確識別攜帶者。目前，臨床上篩查β-地貧攜帶者的一個金標準是檢測血紅蛋白A2（Hb A2）的水平。在健康人中，Hb A2約占血紅蛋白總量的2.5%-3.5%，而β-地貧攜帶者的Hb A2水平通常會升高（>3.5%）。因此，當一個人的平均紅細胞體積（MCV）和平均紅細胞血紅蛋白量（MCH）偏低，同時Hb A2升高時，醫(yī)生就會高度懷疑其為β-地貧攜帶者，并建議進行基因檢測以確認。
然而，這個看似明確的診斷標準有時也會“失靈”。臨床上，醫(yī)生們會遇到一些具有典型β-地貧血液學表型（即MCV和MCH降低）的個體，但其Hb A2水平卻處于正常的臨界范圍（例如3.0%-3.5%）。這種情況讓診斷變得模糊，極易導致攜帶者狀態(tài)的漏診或誤判。是什么原因導致了這些“不典型”病例的出現(xiàn)呢？已知可能降低Hb A2水平的因素包括缺鐵、α-地中海貧血特征以及δ-珠蛋白基因（HBD）的突變。其中，HBD基因編碼Hb A2的δ鏈，其突變雖然本身通常不引起臨床癥狀，但若與β-地貧突變同時存在，則可能“掩蓋”Hb A2升高的典型特征，形成所謂的“正常Hb A2型β-地中海貧血”，給臨床篩查帶來挑戰(zhàn)。
為了揭示這一現(xiàn)象背后的遺傳學機制，并提高診斷的準確性，一項發(fā)表在《Annals of Hematology》上的研究，對一個來自中國深圳的家族進行了深入探究。該家族中的先證者（即索引病例）具有β-IVS-II-654/βN的基因型，這是一種常見的β+-地中海貧血類型，通常伴有Hb A2升高。然而，她的血紅蛋白電泳結果顯示Hb A2僅為3.1%，處于正常范圍。為了尋找原因，研究人員在排除了合并α-地貧和缺鐵等因素后，將目光投向了HBD基因。
關鍵研究方法
本研究綜合運用了多種技術手段：首先，通過毛細管電泳進行血紅蛋白分析，獲取Hb A2的定量數(shù)據(jù)。其次，利用包括多重缺口聚合酶鏈式反應（Gap-PCR）和反向點雜交（RDB）在內的常規(guī)方法篩查了23種常見的地中海貧血變異。接著，對β-和δ-珠蛋白基因進行Sanger測序，以發(fā)現(xiàn)可能的罕見突變。在發(fā)現(xiàn)新型突變后，采用迷你基因剪接分析在體外驗證該突變對mRNA剪接的影響。最后，設計特異性引物，對先證者外周血樣本的cDNA進行PCR擴增和測序，在體內驗證突變轉錄本的存在。
研究結果
1. 鑒定出一種新型HBD基因內含子突變
通過對先證者及其家族成員的HBD基因進行測序，研究人員發(fā)現(xiàn)了一個新的雜合性內含子突變，其編號為NM_000518.5:c.93-21G > A（見圖1A）。該突變在公共數(shù)據(jù)庫HbVar中未見報道，屬于新發(fā)現(xiàn)的突變。
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2. 突變與β-地貧共遺傳導致正常Hb A2表型
家系分析顯示，該HBD基因突變與β-地貧突變（β-IVS-II-654）呈順式排列（即位于同一條染色體上），共同遺傳給了先證者、先證者的父親及新生兒女兒。攜帶這兩種突變的個體，其Hb A2水平均處于正常范圍（2.9%-3.5%），但血液學上仍表現(xiàn)為與單純β+-地貧攜帶者 indistinguishable 的小細胞低色素性貧血。這表明該HBD突變并不改變β-地貧攜帶者的貧血程度，僅特異性地影響了Hb A2的水平。
3. 突變激活隱蔽剪接位點導致內含子保留
生物信息學工具（Splice AI）預測，該突變會創(chuàng)建一個新的剪接受體位點（Acceptor Gain，得分0.84）（見圖1B）。為驗證此預測，研究人員進行了迷你基因剪接實驗。結果證實，該突變導致了HBD基因第1內含子中19個堿基的保留（c.92_93ins19），插入位置與預測完全吻合（見圖1C）。體內驗證實驗利用特異性引物成功從先證者cDNA中擴增出含有這19個堿基插入的轉錄本片段，進一步證實了異常剪接事件在體內的發(fā)生（見圖2）。
4. 異常剪接觸發(fā)無義介導的mRNA降解（NMD）
這19個堿基的插入導致閱讀框移碼，并在下游產(chǎn)生了一個提前終止密碼子（PTC）。在真核生物中，含有PTC的異常mRNA通常會通過一種叫做無義介導的mRNA降解的細胞監(jiān)視機制被識別并降解。因此，可用于翻譯的、編碼正常δ-珠蛋白鏈的mRNA數(shù)量減少，最終導致Hb A2的合成降低。這解釋了為何攜帶該HBD突變的β-地貧個體，其Hb A2水平未能如預期般升高。
結論與意義
本研究成功在一個中國家庭中鑒定出一種新型的HBD基因剪接突變（c.93-21G>A），并闡明了其導致β-地貧攜帶者出現(xiàn)正常水平Hb A2的分子機制。該機制可概括為：突變激活隱蔽剪接位點 → 導致內含子保留和移碼 → 產(chǎn)生提前終止密碼子（PTC） → 觸發(fā)無義介導的mRNA降解（NMD） → δ-珠蛋白鏈合成減少 → Hb A2水平降低。
這項研究具有重要的臨床意義。首先，它揭示了“正常Hb A2型β-地中海貧血”的一種新遺傳病因，提醒臨床醫(yī)生和檢驗人員在遇到血液學表型典型但Hb A2處于臨界或正常范圍的個體時，應考慮是否存在HBD基因突變共遺傳的可能性。其次，研究強調了在常規(guī)地貧基因檢測panel中納入HBD基因測序的必要性，特別是在高發(fā)地區(qū)，以避免因漏診而影響遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷的準確性。最后，該發(fā)現(xiàn)豐富了人類HBD基因的突變譜，增進了我們對珠蛋白基因表達調控復雜性的理解。總之，這項研究為改善β-地中海貧血的精準診斷和預防策略提供了關鍵的科學依據(jù)。
