《Archives of Virology》：Detection, genetic characterization and reassortment analysis of Tribe? virus
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本研究針對蜱傳環(huán)狀病毒（Orbivirus）中的Tribe?病毒（TRBV）遺傳多樣性與進化機制開展調(diào)查。研究人員通過新設(shè)計的RT-PCR方法在斯洛伐克地區(qū)山羊攜帶的篦子硬蜱（Ixodes ricinus）中檢測并分離到一株新病毒株，利用免疫熒光、病毒復(fù)制動力學(xué)及全基因組測序等技術(shù)進行鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析。研究首次發(fā)現(xiàn)該毒株存在基因組重配（reassortment）事件，其編碼NS1蛋白的第4基因組片段可能源自1960年代的原型毒株。這一結(jié)果為理解蜱傳環(huán)狀病毒的傳播、生態(tài)學(xué)及潛在的致病機制提供了重要依據(jù)，并強調(diào)了對神經(jīng)系統(tǒng)感染進行更廣泛鑒別診斷的必要性。
在歐洲和亞洲的森林與草地中，篦子硬蜱（Ixodes ricinus）等蜱類不僅是蜱傳腦炎病毒（TBEV）的傳播者，還攜帶著一群不那么引人注目但同樣具有潛在威脅的病原體——蜱傳環(huán)狀病毒（tick-borne orbiviruses）。其中，Tribe?病毒（TRBV）、Kemerovo病毒（KEMV）、Lipovník病毒（LIPV）和日本的Muko病毒（MUKV）都屬于大島病毒（Great Island virus, GIV）血清群。這些病毒與TBEV共享相似的生態(tài)位和傳播循環(huán)。已有報告將KEMV、LIPV和TRBV的感染與不明病因的神經(jīng)系統(tǒng)疾病病例聯(lián)系起來，感染癥狀可能與蜱傳腦炎相似。然而，由于缺乏特異性的臨床癥狀，加之診斷上的挑戰(zhàn)，這些病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）感染的鑒別診斷中常常被忽視。例如，在斯洛伐克，2016年至2018年間，有40%的病毒性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染被診斷為“非特異性病毒性腦炎、腦膜炎或病毒性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染”，這凸顯了對這些“被遺忘”的病毒加強監(jiān)測和理解其進化動力學(xué)的迫切需求。為了更深入地了解TRBV的遺傳多樣性、潛在的進化機制及其在自然界中的循環(huán)，研究人員在斯洛伐克開展了一項研究。
本研究主要應(yīng)用了以下幾個關(guān)鍵技術(shù)方法：首先，研究人員從斯洛伐克杜布拉瓦地區(qū)放牧的山羊身上收集了篦子硬蜱，并采集了山羊血清樣本。其次，研究團隊為新檢測目的設(shè)計了一對特異性引物，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）對蜱樣本進行病毒篩查。第三，利用Vero E6細胞對RT-PCR陽性的蜱懸液進行病毒分離，并通過免疫熒光技術(shù)（immunofluorescence）和中和試驗（neutralization test）分別進行病毒抗原鑒定和山羊血清抗體檢測。第四，研究了新分離毒株在嚙齒動物（BHK-21）、人（HFF-1）和牛（BT）細胞系中的復(fù)制動力學(xué)。最后，通過下一代測序（next-generation sequencing）獲取了病毒的全基因組序列，并利用系統(tǒng)發(fā)育分析（phylogenetic analysis）和重組檢測程序（Recombination Detection Program 4， RDP4）等生物信息學(xué)工具進行遺傳特征和重配分析。
Detection and isolation of TRBV in ticks（TRBV的檢測與分離）
研究團隊新設(shè)計了一對針對GIV血清群病毒第1基因組片段的引物，其RT-PCR檢測限為103PFU/ml。從一只飽血雌性篦子硬蜱的勻漿中檢測到病毒RNA，并通過測序證實其為TRBV。將該勻漿接種Vero E6細胞后，成功分離到一株新的TRBV毒株，命名為16.C/2016/Dubrava/SVK。
Prevalence of TRBV neutralization antibodies in grazing goats（放牧山羊中TRBV中和抗體的流行率）
對同一地區(qū)放牧山羊的血清學(xué)監(jiān)測顯示，所有動物在研究期間均保持臨床健康。2016年未檢測到中和抗體，2017年9只山羊中有5只（55.6%）出現(xiàn)低滴度（1:10至1:20）的血清陽轉(zhuǎn)，表明它們在該地區(qū)感染了TRBV或相關(guān)病毒。
The replication of TRBV isolate in rodent, human and bovine cell lines（TRBV分離株在嚙齒類、人和牛細胞系中的復(fù)制）
病毒復(fù)制動力學(xué)研究表明，新毒株在三種細胞系中均能復(fù)制并引起細胞病變效應(yīng)（CPE），但效率不同。在嚙齒類BHK-21細胞中復(fù)制效率最高，病毒滴度持續(xù)上升至72小時，達到5.75 × 105PFU/ml。而在人源HFF-1和牛源BT細胞中，病毒復(fù)制受到一定限制，峰值滴度分別為6.83 × 103PFU/ml和5.00 × 104PFU/ml，這可能與這些細胞完整的I型干擾素應(yīng)答有關(guān)。
Genetic and phylogenetic analysis（遺傳與系統(tǒng)發(fā)育分析）
對新毒株進行全基因組測序和比對分析發(fā)現(xiàn)，其大多數(shù)基因組片段與其他TRBV毒株以及日本的MUKV毒株具有較高的序列一致性。然而，編碼外衣殼蛋白VP4（OC1）的第5片段是一個例外，它與俄羅斯的KEMV毒株在序列一致性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系上更為接近。此外，編碼NS3糖蛋白的第10片段顯示出最高的遺傳變異性：斯洛伐克和羅馬尼亞的TRBV毒株與MUKV聚為一支，而烏克蘭的TRBV毒株則與KEMV形成姊妹支。
Reassortment analysis（重配分析）
利用RDP4軟件對串聯(lián)的TRBV基因組序列進行分析，預(yù)測到一個重配事件。該事件得到六種檢測方法的支持，預(yù)測的重組斷點位于串聯(lián)序列的第8191和10049位點，對應(yīng)于第4基因組片段。SimPlot分析進一步支持了這一發(fā)現(xiàn)。這表明新分離株16.C/2016/Dubrava/SVK的第4片段（編碼NS1蛋白）可能源自20世紀(jì)60年代在斯洛伐克分離的原型TRBV毒株。
本研究總結(jié)與討論部分強調(diào)了蜱傳環(huán)狀病毒在診斷和公共衛(wèi)生方面的重要性。研究成功從斯洛伐克地區(qū)的蜱體內(nèi)分離并鑒定了新的TRBV毒株，證實了該病毒在當(dāng)?shù)刈匀灰咴吹刂械某掷m(xù)循環(huán)。血清學(xué)證據(jù)表明，放牧山羊可以成為監(jiān)測蜱傳病毒暴露的有用哨兵動物。
遺傳分析揭示了TRBV復(fù)雜的進化圖景。雖然TRBV、MUKV、LIPV和KEMV目前被歸類為同一病毒物種（GIV）的不同血清型，但本研究和先前工作表明，它們在關(guān)鍵的RdRp和T2蛋白上的序列一致性低于物種劃分的典型閾值，提示它們可能代表地理分布廣泛的、不同的環(huán)狀病毒譜系。特別值得關(guān)注的是，新毒株的外衣殼蛋白VP4（OC1）在系統(tǒng)發(fā)育上與KEMV聚在一起，而其他內(nèi)部蛋白則與TRBV/MUKV分支更近，這種“鑲嵌式”的基因組構(gòu)成是病毒進化中重配事件的典型特征。研究明確鑒定出新毒株的第4片段（編碼NS1蛋白）可能源自歷史毒株，這是首次在TRBV中報道自然發(fā)生的重配事件。NS1蛋白是病毒蛋白合成的正調(diào)節(jié)因子，其重配可能影響病毒在宿主或媒介中的適應(yīng)性和復(fù)制效率，這在對藍舌病病毒（bluetongue virus, BTV）的研究中已有先例。
此外，研究觀察到第10片段（編碼NS3/NS5蛋白）的高變異性，這可能影響病毒在細胞內(nèi)的運輸和釋放機制，進而影響其在不同媒介或宿主中的傳播效率。
在討論中，作者指出，盡管蜱傳環(huán)狀病毒在IFN-Ⅰ型反應(yīng)完備的細胞中復(fù)制受限，但它們?nèi)阅艹晒?fù)制，提示其可能存在如NS4蛋白介導(dǎo)的免疫逃逸機制，這一點值得未來研究。最后，作者呼吁有必要開展進一步研究，以闡明這些病毒的生態(tài)學(xué)、宿主免疫反應(yīng)及其抗病毒逃避機制，特別是考慮到它們與不明病因的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛在關(guān)聯(lián)，以及在全球氣候變化和人類活動影響下蜱媒疾病負擔(dān)可能增加的趨勢。
本研究發(fā)表在《Archives of Virology》上，為理解蜱傳環(huán)狀病毒的遺傳多樣性、進化動力學(xué)及其在自然界的維持機制提供了新的重要數(shù)據(jù)，強調(diào)了在病毒性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染鑒別診斷中考慮這些病原體的必要性，并為未來的監(jiān)測和防控策略提供了科學(xué)依據(jù)。
