《Frontiers in Plant Science》：Genetic diversity and population differentiation of Parrotia subaequalis revealed by RAD-seq
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本研究運用簡化基因組測序（RAD-seq）技術，對中國特有、極度瀕危（CR）的孑遺樹種小葉金縷梅（Parrotia subaequalis）的9個自然種群、233個個體進行了基因組層面的遺傳學解析。研究通過高通量單核苷酸多態性（SNP）分析，首次揭示了該物種中等偏低但分布不均的遺傳多樣性水平（如平均核苷酸多樣性Pi≈3.7×10-5），并明確了其地理遺傳結構：桃嶺（TL）種群獨立成系，其余種群可大致分為大別山核心區和外圍過渡群體兩大集群。種群間遺傳分化指數（Fst）范圍在0.0168至0.1082之間，表明存在弱到中度的分化。此結果為制定基于遺傳保護單元（conservation unit）的原位（in situ）與遷地（ex situ）保育策略提供了關鍵的基因組學證據。
引言
小葉金縷梅（Parrotia subaequalis）是金縷梅科中極具代表性的東亞第三紀孑遺樹種，與伊朗的波斯鐵木（Parrotia persica）為該屬僅存的兩個物種，具有重要的系統發育地位。因其絢麗的秋色、優美的樹冠和可作藥用的次生代謝產物（如鞣質、苯并呋喃類植保素）而具有觀賞、科研及潛在藥用價值。然而，在人類干擾加劇、棲息地退化與破碎化的背景下，其野生種群天然更新困難，種群規模顯著下降，已被世界自然保護聯盟（IUCN）列為極度瀕危（CR）物種。野生小葉金縷梅主要間斷分布于安徽、江蘇、浙江的低中山區，其中大別山南坡是其核心分布區。遺傳多樣性與種群結構是評估瀕危植物生存潛力和制定有效保護策略的重要科學基礎。本研究運用簡化基因組測序（RAD-seq）技術，對來自安徽及鄰近地區9個自然種群的233個個體進行分析，旨在：（1）評估其自然種群的遺傳多樣性水平；（2）揭示種群間的遺傳結構與地理分化；（3）探討地理隔離與歷史過程在種群分化中的作用，為理解和保護這一瀕危物種提供遺傳學依據。
材料與方法
研究共采集了9個種群233個個體的新鮮葉片樣品，其地理位置、種群代碼和規模詳見圖1和表1。采用改進的CTAB法提取基因組DNA。利用EcoRI單酶切策略構建了平均插入片段約350 bp的雙末端RAD-seq文庫，并在Illumina NovaSeq 6000平臺上進行150 bp雙端測序。原始數據經fastp質控過濾后，比對至本研究基于公開的牛津納米孔長讀長數據和Hi-C數據從頭組裝的染色體水平參考基因組。利用SAMtools mpileup和bcftools調用單核苷酸多態性（SNP），經過濾后得到136,252個高質量SNP用于后續分析。采用主成分分析（PCA）、群體遺傳結構推斷（ADMIXTURE）、基于鄰接法（neighbor-joining, NJ）的系統發育樹構建、成對群體分化指數（Fst）計算、核苷酸多樣性（π）分析以及連鎖不平衡（LD）衰減分析等多種方法，全面評估了種群的遺傳結構、分化程度和多樣性。
結果
3.1 種群遺傳結構分析
PCA、ADMIXTURE和系統發育分析結果高度一致，共同支持小葉金縷梅存在一個清晰的三分遺傳結構。PCA結果顯示，桃嶺（TL）種群在二維空間中獨立成簇，與其他所有種群明顯分離（圖2a）。龍池山（LCS）和固井源（SDG）種群表現出遺傳上的親近性和部分重疊，而其余六個大別山區域種群（ND, MD, SDH, SDL, QLF, LWS）聚集為另一大群。在K=3的ADMIXTURE分析中，TL種群幾乎由單一祖先成分構成，而LCS、SDG和QLF等種群則表現出不同程度的混合。
3.2 種群間遺傳分化
成對Fst分析（圖3a）表明種群間存在弱到中度的遺傳分化（范圍0.0168-0.1082）。其中，TL種群與其他所有種群的Fst值均較高（0.076-0.108），分化最顯著，尤其與龍王山（LWS）種群的分化最強。大別山區域內部種群間的分化則較弱。鄰接樹（圖3b）進一步支持了這一結果，TL種群形成一個獨立且支持度高的分支，而大別山種群則緊密聚集在一起。
3.3 遺傳多樣性
遺傳多樣性分析顯示，物種整體遺傳多樣性處于中等偏低水平。平均等位基因數（Na）為1.83，有效等位基因數（Ne）為1.24，多態信息含量（PIC）為0.146，核苷酸多樣性（Pi）為0.000037，觀測雜合度（Ho）和期望雜合度（He）分別為0.092和0.170（表2）。不同種群間多樣性分布不均，LWS種群具有最寬的π分布和最高的Pi值（0.0000558），而大別山核心區種群的π分布更集中，值相對較低。TL種群的多樣性參數（Na, He, PIC）在所有種群中最低。連鎖不平衡（LD）衰減分析（圖4b）顯示，LWS種群LD衰減最慢，暗示其有效種群規模（Ne）可能發生過變化或持續較小，加劇了遺傳漂變。
3.4 地理分布與遺傳結構的關系
遺傳結構與地理分布高度相關。大別山區域種群（主要分布在長江以北）在遺傳空間緊密聚集，分化弱。而位于物種分布區南緣（長江以南）的TL種群，與其他種群在PCA和系統發育樹中均明顯分離，顯示出獨特的遺傳結構。長江水系和區域山地分布共同構成了基因流動的障礙，塑造了當前“強結構、中度但不均多樣性”的地理遺傳格局。
討論
相比傳統分子標記，RAD-seq生成的高密度SNP數據集顯著提高了遺傳結構推斷的準確性。本研究結果與先前基于ISSR、SSR/cpSSR標記的研究結論一致，均證實小葉金縷梅種群間分化強、基因流受限。其“強結構、中度但高度不均多樣性”的模式，是種群水平的生態過程（如空間聚集、小種群效應）、景觀阻力（復雜山地地形、河流隔離）及歷史氣候事件共同作用的結果。TL種群表現出最低的多樣性、最慢的LD衰減，可能源于長期隔離的孑遺譜系或近期因棲息地破碎化和人類干擾導致的嚴重種群收縮。這突顯了其不可替代的進化獨特性和高度的遺傳風險。
基于以上發現，研究提出了分層級的保護框架。TL種群應作為高優先級保護目標，重點實施原位（in situ）保育和生境管理，以最小化干擾和隔離帶來的遺傳風險。多樣性相對較高的大別山核心區種群（如SDH、MD、SDL、QLF）可被視為物種遺傳變異的關鍵儲存庫，保育應優先維持其生境完整性和種群穩定性，并在可行時提升景觀連通性。對于LWS這類保有獨特變異的種群，需加強區域尺度的生境質量與連通性保護。對于ND、SDG、LCS等中等多樣性種群，保護規劃需綜合考慮地形屏障和景觀阻力對基因流的影響。此外，遷地（ex situ）保護應基于主要遺傳集群進行代表性取樣，以確保捕獲譜系水平的多樣性。
本研究揭示的“中度多樣性、明確分化、多個獨立遺傳單元”的模式，是許多狹域分布孑遺樹種的典型特征。這警示我們，基于物種水平平均指標的評估可能低估風險，需轉向基于譜系或管理單元的保護決策框架。未來的研究可通過整合全基因組重測序、群體歷史建模和基因組-環境關聯分析，進一步闡明譜系分化機制，為小葉金縷梅及其他東亞孑遺瀕危植物的科學保護提供更精細的指導。
