《Frontiers in Microbiology》：Bactericidal and antibiofilm activity of lactic acid bacteria-derived cell free extracts against dairy-associated spoilage and pathogenic bacteria
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本研究系統(tǒng)評估了15株乳酸菌（LAB）通過五種提取物（CFS、IC、ICS及其中和變體）的抗菌與抗生物膜潛力。采用瓊脂擴散、生長抑制、生物膜抑制、最小抑菌濃度（MIC）與最小殺菌濃度（MBC）測定等方法，結合高效液相色譜（HPLC）、細胞泄漏、殺菌動力學（Time-kill）及掃描電子顯微鏡（SEM）分析，篩選出對乳品相關病原體與腐敗菌具有最強拮抗活性的菌株-提取物組合，揭示了有機酸在抑菌中的核心作用，為開發(fā)用于乳品系統(tǒng)的天然生物防控劑提供了科學依據(jù)。
引言：挑戰(zhàn)與機遇
微生物污染一直是奶酪等乳制品生產中的主要挑戰(zhàn)之一，食源性病原體（如沙門氏菌、單核細胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、致病性大腸桿菌）和腐敗微生物（特別是假單胞菌屬和腸桿菌科細菌）可嚴重影響產品質量、縮短貨架期并威脅消費者健康。這些污染與生產、處理或儲存過程中的諸多環(huán)節(jié)有關，包括擠奶衛(wèi)生不佳、設備清潔消毒不徹底導致生物膜形成、冷鏈溫度控制不當、巴氏殺菌后的二次污染以及環(huán)境衛(wèi)生管理不善等。這些挑戰(zhàn)凸顯了對有效、天然的乳品微生物控制策略的需求。
在此背景下，乳酸菌在食品發(fā)酵中扮演著核心角色，其產生的有機酸、細菌素等抗菌代謝物能夠抑制有害微生物。近年來，研究的興趣已擴展到使用乳酸菌來源的提取物，這類提取物包含從滅活細胞和培養(yǎng)上清液中獲得的生物活性化合物。與依賴活微生物的益生菌或生物防腐劑培養(yǎng)物不同，乳酸菌提取物僅通過代謝產物發(fā)揮作用，使其在清潔標簽食品應用中更具吸引力。這些提取物包括無細胞上清液、富含胞外代謝物的培養(yǎng)基以及細胞滅活后釋放的胞內成分，代表了一組多樣化的生物活性微生物產品。盡管物理、化學和生物處理方法的聯(lián)合應用通常能增強微生物滅活效果，但單個乳酸菌提取物中多種代謝物的協(xié)同作用也可能增強其抗菌效力。乳酸菌來源的化合物已在食品系統(tǒng)中顯示出對抗生物膜形成和微生物污染的良好活性，這順應了市場對天然、最小加工產品的需求增長。
然而，對多種乳酸菌菌株及其衍生物提取物（特別是在食源性病原體和乳制品相關腐敗菌背景下）的比較性評價仍然有限。此外，不同提取物制備物中，有機酸、細胞相關成分及其他代謝物對抗菌活性的相對貢獻尚未被完全闡明。評估僅含上清液、僅含滅活細胞或兩者組合（包括原生和中和版本）的提取物，有助于闡明微生物抑制的潛在機制，并支持其在乳品系統(tǒng)中的合理應用。
材料與方法：系統(tǒng)篩選與評價
本研究旨在對15株乳酸菌（LAB）進行抗菌和抗生物膜活性的比較篩選，以針對乳品相關的腐敗和病原微生物。系統(tǒng)地評估了五種類型的乳酸菌提取物（無細胞上清液CFS、滅活細胞IC、兩者組合ICS，以及它們的中和變體CFS N和ICS N），以確定有機酸和細胞相關成分對微生物抑制的貢獻。這種方法能夠識別和選擇出最有效的菌株-提取物組合，為乳品系統(tǒng)開發(fā)天然生物防控劑奠定基礎。
研究中使用了15株乳酸菌和7株致病及腐敗微生物。通過瓊脂擴散法初步篩選抗菌活性。隨后，利用微孔板法測定提取物的拮抗和抗生物膜活性，并計算抑制百分比。通過Z-score分析對抗菌和抗生物膜結果進行標準化，以識別性能一致的提取物。進一步測定了最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC）。對活性提取物，采用高效液相色譜（HPLC）分析有機酸譜，通過細胞泄漏實驗檢測核酸釋放，使用時間-殺菌動力學（Time-kill）實驗評估殺菌速率，并利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察細菌細胞形態(tài)變化。所有實驗均進行統(tǒng)計學分析。
結果：活性、機制與成分
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抗菌與抗生物膜效應
瓊脂擴散實驗表明，單核細胞增生李斯特菌ATCC 19117和熒光假單胞菌07A顯示出最大的抑菌圈，但抑制模式因菌株而異。生長抑制和抗生物膜實驗進一步證實了乳酸菌提取物的潛力。pH測定顯示，CFS和ICS呈酸性（pH 3.84-4.61），而其中和變體接近中性。Z-score分析鑒定出植物乳桿菌Q4C3、乳酸乳球菌亞種ATCC 13675、ATCC 19435、Lc08和食竇魏斯氏菌W21是在各實驗中表現(xiàn)出最一致抑制性能的菌株。熱圖分析表明，CFS和ICS是總體上最有效的提取物類型。
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最低抑菌濃度與殺菌濃度
CFS和ICS表現(xiàn)出最低的MIC值，具體取決于菌株和目標物種。來自植物乳桿菌Q4C3、乳酸乳球菌Lc08和食竇魏斯氏菌W21的提取物最常觀察到較低的MIC值。相比之下，中和后的提取物對大多數(shù)目標微生物顯示出減弱或無抑制活性。在評估的提取物中，只有CFS和ICS顯示出殺菌活性，因此被選擇用于后續(xù)的細胞泄漏、時間-殺菌和SEM分析。
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細胞泄漏
細胞泄漏分析顯示，在所有評估的菌株中，CFS處理比ICS處理導致更高的胞外核酸水平。其中，來自乳酸乳球菌生物變型丁二酮乳亞種SBR4、植物乳桿菌Q4C3、食竇魏斯氏菌W21和綠色魏斯氏菌W23的提取物產生了最高的泄漏值。
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時間-殺菌動力學
以熒光假單胞菌07A和單核細胞增生李斯特菌ATCC 19117為代表菌株進行時間-殺菌評估。CFS處理在4小時內導致菌落數(shù)降低超過3個對數(shù)值（log10CFU/mL），而ICS處理在同一時間內產生約2個對數(shù)值的降低。對于CFS，6小時后未檢測到活細胞。對于ICS，4小時后檢測到存活的熒光假單胞菌細胞，但在6小時后顯著減少。因此，選擇4小時作為后續(xù)實驗中ICS和CFS處理的接觸時間。
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有機酸定量分析
檢測到的有機酸包括乳酸、甲酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸。與CFS相比，ICS中所有菌株的有機酸濃度均較低。有機酸的種類和濃度在不同提取物間差異顯著。
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掃描電鏡觀察
SEM圖像揭示了細菌細胞在暴露于乳酸菌提取物后的結構改變。對于熒光假單胞菌07A，經CFS處理的細胞比ICS處理的細胞表現(xiàn)出更廣泛的變形。單核細胞增生李斯特菌也觀察到類似模式。兩種菌的對照細胞均保持完整形態(tài)，而處理過的細胞則表現(xiàn)出不同程度的表面不規(guī)則，包括凹陷和扭曲。與ICS相比，CFS處理的細胞形態(tài)變化始終更明顯。
討論：機制、菌株差異與應用潛力
本研究中，乳酸菌提取物對乳品系統(tǒng)中相關的食源性病原體和腐敗微生物表現(xiàn)出顯著的抗菌和抗生物膜活性，但其抑制強度和范圍具有明顯的菌株依賴性。一個貫穿各實驗的一致發(fā)現(xiàn)是，非中和提取物（CFS和ICS）在MIC值和抗生物膜活性方面均優(yōu)于其中和版本（CFS-N和ICS-N）。這種模式支持了有機酸在乳酸菌提取物抗菌作用中的核心作用。中和后活性的部分或完全喪失，強化了這一解釋，并與之前關于非中和植物乳桿菌上清液具有強抗菌活性、中和后消失的報道一致。
所獲有機酸譜有助于解釋觀察結果。乳酸、乙酸和丙酸檢測濃度最高，甲酸、檸檬酸、琥珀酸、丁酸和戊酸也有貢獻。從CFS到ICS的轉變伴隨著有機酸濃度的普遍降低和pH值的輕微上升，表明由于細胞裂解后胞內液的釋放導致了酸的部分中和。弱酸在低pH下顯示出更強的抗菌活性，乙酸和丙酸通常比乳酸具有更強的抑制作用，因為其較高的pKa值有利于在酸性環(huán)境中形成更高比例的非解離分子。在混合酸體系中，乳酸主要有助于降低pH，而乙酸和丙酸則作為主要的抗菌成分，通常表現(xiàn)出協(xié)同效應。因此，CFS和ICS中有機酸的組成和濃度強烈影響觀察到的抑制譜。
盡管pH中和實驗為酸介導的抗菌機制提供了有價值的見解，但它們并不排除pH敏感的細菌素或其他代謝物的貢獻。乳酸菌產生的幾種抗菌肽已知在酸性條件下更具活性和穩(wěn)定性，而在中性或堿性pH下，由于電離狀態(tài)變化和部分肽變性，活性降低或結構不穩(wěn)定。因此，中和后觀察到的抗菌效力降低，可能不僅反映了有機酸活性的喪失，也反映了細菌素和其他酸依賴性代謝物功能的減弱。
與這一解釋一致，在某些中和提取物中檢測到的殘留抗菌活性表明存在額外的、酸非依賴性代謝物的貢獻。例如，乳酸乳球菌Lc08在中和后保留了抗菌活性，這與之前描述其產生在寬pH范圍內穩(wěn)定、僅在高壓滅菌后才失活的拮抗化合物的報告一致。同樣，被鑒定為尼生素Z產生菌的乳酸乳球菌生物變型丁二酮乳亞種SBR4，其中和后的行為與其已知特性一致。總之，這些結果支持一個模型，即有機酸提供基礎的抗菌效應，而細菌素可進一步增強此效應。
魏斯氏菌屬菌株也成為了乳品環(huán)境中生物防治的有前景候選者。本研究表明，食竇魏斯氏菌W21、W22和綠色魏斯氏菌W23結合了相關的抗菌和抗生物膜活性。一些魏斯氏菌源提取物在中和后仍保留部分活性，表明其產生了除有機酸外的其他生物活性代謝物，加強了該屬作為細菌素和提取物制備來源的潛力。
盡管魏斯氏菌菌株已顯示出相關的抗菌和抗生物膜潛力，但其作為活菌培養(yǎng)物的應用需謹慎對待。該菌株尚未完全建立安全性。這種監(jiān)管限制凸顯了在工業(yè)應用前進行菌株特異性安全性評估的必要性。在此背景下，應用源自魏斯氏菌的無細胞提取物代表了一種更安全的替代方案，允許利用有機酸和細菌素等生物活性代謝物，而無需承擔施用活微生物的相關風險。
除了安全性考慮，生物防治策略的另一層復雜性在于，對浮游細胞的抗菌效力并不一定能有效轉化為生物膜抑制。這種差異表明，生物膜抑制不能僅僅歸因于活細胞數(shù)量的減少。乳酸菌衍生的代謝物，如過氧化氫、含氧化合物、胞外多糖、細菌素和具有表面活性的脂肪酸，已被確定為關鍵的抗生物膜劑。在本研究中，乳酸菌提取物對腐敗和病原微生物表現(xiàn)出菌株依賴性的抗菌和抗生物膜活性，突出了拮抗機制的多樣性。Z-score排名和生長/生物膜抑制數(shù)據(jù)證實，只有一部分乳酸菌菌株在兩種表型上都能持續(xù)表現(xiàn)出高性能，這強調了在設計生物防治策略時需要進行菌株水平篩選的重要性。
在此背景下，乳酸菌提取物的物理組成，特別是ICS中細胞碎片的存在，成為影響抗菌和抗生物膜性能的關鍵因素。一些處理中細胞碎片的存在與抗菌潛力的降低有關，特別是對于ICS。一種可能的解釋是，細胞殘留物、胞外聚合物、蛋白質、脂質和核酸可能在靶細胞周圍形成物理屏障，部分屏蔽了可擴散的抗菌代謝物。相反，其他研究表明，滅活的乳酸菌細胞可以通過在表面形成物理層來減少病原體的粘附，從而限制其定植。這些看似矛盾的觀點突顯了細胞碎片的作用是依賴于具體情境的，并受到基質組成、微生物種類以及可擴散成分與細胞相關成分相對貢獻等因素的影響。在我們的實驗條件下，過濾和去除細胞殘留物提高了抗菌性能，這與觀察到的CFS比ICS活性更高一致。在實際應用中，乳酸菌提取物在真實食品系統(tǒng)中的行為受到周圍基質的影響。有機質可以調節(jié)酸的效力，根據(jù)酸的種類和食品環(huán)境，某些成分會降低，而另一些則會增強抗菌效果。
除了基質相關效應，靶微生物之間固有的結構差異也影響了乳酸菌提取物的效力。一個值得注意的結果是CFS能夠抑制革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。雖然細菌素通常對革蘭氏陽性菌更有效，但CFS中有機酸和其他代謝物的組合可能會通過增加膜通透性來破壞革蘭氏陰性菌的外膜屏障。先前的研究表明，乳酸菌的有機酸和CFS可以誘導K+離子、核酸和蛋白質的泄漏，反映了對細胞質膜的直接損傷。MIC和時間-殺菌數(shù)據(jù)，連同泄漏實驗，支持一種機制，即酸和相關代謝物促進生物活性化合物接近細胞膜，從而將抑制譜擴大到包括假單胞菌屬等革蘭氏陰性腐敗菌。
細胞泄漏和SEM分析為乳酸菌提取物的作用模式提供了進一步的見解。CFS處理始終比ICS導致更高的胞外核酸水平，SEM圖像顯示暴露于CFS的熒光假單胞菌和單核細胞增生李斯特菌細胞發(fā)生顯著的形態(tài)改變，包括表面塌陷、皺縮和結構扭曲。這些發(fā)現(xiàn)與之前報道乳酸菌CFS處理導致細菌膜損傷、細胞腫脹、液泡形成和胞內成分泄漏的研究一致。綜合來看，這些觀察結果支持了乳酸菌衍生代謝物與膜磷脂和蛋白質相互作用、改變膜流動性、促進孔道形成并最終導致泄漏和細胞死亡的觀點。
時間-殺菌實驗揭示的快速殺菌動力學，進一步反映了通過SEM和核酸釋放實驗觀察到的膜損傷和泄漏效應。時間-殺菌實驗不僅突出了提取物的殺菌能力，也凸顯了其作用速度。對于單核細胞增生李斯特菌，CFS導致了活菌計數(shù)的快速下降，而熒光假單胞菌需要稍長的暴露時間才能達到類似效果。ICS在兩種情況下都比CFS需要更長的接觸時間。與之前需要更長時間暴露或更高倍MIC才能實現(xiàn)有限對數(shù)值降低的研究相比，本文評估的提取物顯示出更快、更顯著的殺菌活性。這種增強的效力可能反映了有利的有機酸譜和額外的可擴散代謝物的綜合效應，正如MIC/MBC結果以及泄漏和SEM數(shù)據(jù)所提示的那樣。
結論
本研究證明，乳酸菌提取物，特別是來自植物乳桿菌Q4C3、乳酸乳球菌生物變型丁二酮乳亞種SBR4、食竇魏斯氏菌W21和綠色魏斯氏菌W23的CFS，兼具快速殺菌活性、抗生物膜效應以及對乳品相關污染物的廣譜抑制作用。通過系統(tǒng)比較多種乳酸菌菌株和提取物類型，本研究確定了最具工業(yè)應用潛力的菌株和提取物組合。這些發(fā)現(xiàn)支持使用這些提取物作為天然、快速起效的生物防治劑，以提高乳制品的微生物安全性和質量，同時也為未來在真實食品基質和試點規(guī)模應用的研究提供了框架。
