研究團隊為探究生物學性別是否會影響小鼠對約氏瘧原蟲（Plasmodium yoelii, Py）感染的易感性及后續的肝內發育，對成年雄性和雌性BALB/cJ小鼠進行靜脈感染實驗。他們發現，在感染后44小時（hpi），雄鼠的肝臟寄生蟲負荷（通過Plasmodium 18S rRNA RT-PCR定量）比雌鼠高約3倍，表明在寄生蟲的生長或存活上存在性別差異。通過進一步對雄鼠進行睪丸切除（ORX）手術以去除雄激素，發現去勢雄鼠在44 hpi時的肝臟負荷降低，恢復至與雌鼠相似的水平。使用促性腺激素釋放激素（GnRH）拮抗劑Acyline急性抑制睪酮產生，也得到了相同的結果，而補充睪酮則可恢復高寄生蟲負荷。通過熒光顯微鏡計數感染肝細胞和測量寄生蟲大小，研究人員得出結論：雄鼠在44 hpi時更高的負荷主要源于寄生蟲存活率的差異，而非初始入侵或復制速率的差異。

為了探究性別及性激素對宿主應對感染反應的影響，研究團隊利用GeoMx數字空間分析技術（Digital Spatial Profiler），對感染或模擬感染（mock）的雄鼠、雌鼠及去勢雄鼠的肝臟組織進行空間全基因組轉錄組分析。研究在感染后44小時采集肝臟樣本，根據寄生蟲標記物（HSP70）、肝區分區標記物（ASS1，用于標記門靜脈周圍區域）和核染色（Syto83）選擇了多個感興趣區域（ROI），包括寄生蟲所在區域、鄰近的旁觀者區域以及無感染的模擬感染區域，并涵蓋了肝小葉的門靜脈周圍（PP）、中間區（IZ）和中央靜脈周圍（PC）區域。

無監督聚類分析結果顯示，數據主要根據激素狀態（而非單純的生物學性別）進行區分。完整雄鼠（無論感染與否）傾向于聚集在一起，而雌鼠和去勢雄鼠則根據感染狀態進一步區分。在基礎狀態下（模擬感染組），雌鼠和去勢雄鼠在脂肪酸代謝、外源性物質代謝相關基因（如Cyp2b13）上表達較高，而雄鼠則在膽汁酸代謝（如Cyp7b1）和補體/凝血級聯相關基因上表達更高。這證實了雄激素是驅動肝臟基礎狀態基因表達差異的主要因素。

研究利用已發表的單核RNA測序（snRNA-seq）數據對空間轉錄組數據進行細胞類型反卷積分析，以評估基線（模擬感染）狀態下的免疫細胞比例。結果顯示，在模擬感染的組織中，去勢雄鼠的庫普弗細胞（Kupffer cells, KCs）、單核細胞與樹突狀細胞（monocytes and DCs）、T細胞與NK細胞的比例最高，雌鼠次之，完整雄鼠最低。這一發現通過免疫熒光顯微鏡對Kupffer細胞標記物CLEC4F⁺細胞的定量計數得到了驗證，證實雌鼠和去勢雄鼠具有更高的Kupffer細胞基線密度。

通過對比寄生蟲區域與模擬感染區域的基因表達，研究人員評估了不同性別組對Py感染的反應。盡管所有組別在感染后都表現出I型干擾素（IFN）反應的激活，但反應的強度和廣度存在顯著性別差異。與完整雄鼠相比，雌鼠和去勢雄鼠在感染區域誘導了更多、更廣泛的差異表達基因，特別是與I型干擾素反應、細胞應激和炎癥相關的基因，如Irf7、Cxcl9、Saa3等。雌鼠表現出最廣泛的干擾素刺激基因（ISGs）上調。此外，在抗原加工與呈遞途徑中，雌鼠和去勢雄鼠也顯示出更強的基因上調，包括MHC I類和II類相關基因（如H2-D1、Cd74）以及參與抗原交叉呈遞的基因Mpeg1。

細胞反卷積分析顯示，在感染小鼠的寄生蟲周圍區域，雌鼠和去勢雄鼠的Kupffer細胞、單核細胞與樹突狀細胞比例顯著高于完整雄鼠。顯微鏡計數再次證實，感染后，雌鼠和去勢雄鼠仍保持著比雄鼠更高的CLEC4F⁺Kupffer細胞密度。盡管所有組別在感染后，Kupffer細胞向感染部位募集的平均距離都縮短了，但相對于各自模擬感染基線的倍增變化在不同性別組間無顯著差異。這表明，感染后期觀察到的Kupffer細胞數量性別差異，可能主要源于基線密度的固有差異，而非招募活性的內在不同。

本研究揭示了生物學性別和雄激素如何從根本上改變約氏瘧原蟲肝內階段感染的肝臟免疫格局。完整雄鼠表現出更高的寄生蟲存活率，這與它們相對免疫抑制的肝臟微環境相關，其特征包括：基線固有免疫細胞（尤其是Kupffer細胞）密度較低、I型干擾素反應減弱、以及抗原呈遞相關基因的上調受限。雄激素介導的這些差異共同為寄生蟲創造了更有利的生存條件。相反，在雌鼠和去勢雄鼠中，更活躍的炎癥環境、更強的細胞自主清除機制（如與流產感染相關的基因表達）以及更有效的抗原呈遞潛力，共同促進了更有效的寄生蟲清除。研究還指出了鐵穩態、脂質代謝等潛在性別差異途徑可能與寄生蟲發育相關。這些發現將“性別”這一關鍵生物學變量整合到瘧疾肝內階段免疫的空間框架中，強調了在瘧疾研究和疫苗開發中考慮性別因素的重要性。