《Frontiers in Immunology》：The critical role of Atpif1 in Her2-targeted CAR-T cell therapy for solid tumor via modulation of metabolism and mtDNA-STING signal pathway
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本研究揭示了ATPIF1在HER2靶向CAR-T細胞治療實體瘤中的關鍵調控作用。通過調節線粒體代謝重塑和線粒體DNA（mtDNA）泄漏激活的STING信號通路，ATPIF1的表達水平呈現出獨特的雙向調節效應：在體外，ATPIF1過表達可提升CAR-T細胞的殺傷活性和細胞因子分泌；在體內，ATPIF1敲低反而能增強其在低氧腫瘤微環境中的生存、浸潤和抗腫瘤效果，這為優化CAR-T治療實體瘤策略提供了新的代謝干預靶點。
引言
嵌合抗原受體T（CAR-T）細胞療法在血液系統惡性腫瘤中已顯示出顯著的臨床療效，但將其應用于實體腫瘤治療仍面臨巨大挑戰。這主要歸因于腫瘤微環境（TME）的復雜性，包括抗原異質性、T細胞浸潤不足、衰竭以及持久性差等因素。作為細胞能量代謝的中心，線粒體在決定T細胞分化表型和功能中起著核心作用，調控線粒體代謝可塑性被認為是增強CAR-T細胞抗腫瘤活性的有效策略之一。
ATP合酶抑制因子1（ATPIF1，也稱為ATP5IF1）是一種進化上高度保守的線粒體蛋白，它通過結合ATP合酶的F1結構域，選擇性抑制ATP的合成或水解，從而在調控細胞能量代謝中扮演關鍵角色。本研究旨在探究ATPIF1在調控靶向HER2抗原的CAR-T細胞抗實體瘤療效中的作用及其潛在機制。
材料與方法
研究者構建了HER2靶向的CAR-T細胞，并通過基因工程手段分別上調（Her2-IF1 CAR-T）和敲低（Her2-shIF1 CAR-T）其ATPIF1的表達。通過蛋白印記、流式細胞術等方法驗證了CAR和ATPIF1的表達。利用SKBR3-Luc+人乳腺癌細胞系評估CAR-T細胞的體外細胞毒性、白細胞介素-2（IL-2）和干擾素-γ（IFN-γ）的分泌水平。通過Seahorse能量代謝分析儀檢測細胞的耗氧率（OCR）以評估氧化磷酸化水平。在體內，將CAR-T細胞過繼回輸給荷瘤NCG小鼠，通過測量腫瘤體積、重量以及免疫組化染色分析其抗腫瘤效果、細胞浸潤情況。利用Western Blot、實時熒光定量PCR等技術檢測線粒體膜電位（MMP）、線粒體通透性轉換孔（mPTP）開放、線粒體DNA（mtDNA）泄漏及STING信號通路相關蛋白的表達。
結果
ATPIF1過表達在體外增強HER2 CAR-T細胞功能，但在體內效果相反
體外實驗表明，與親本Her2 CAR-T細胞相比，ATPIF1過表達的Her2-IF1 CAR-T細胞具有更強的腫瘤細胞裂解能力，并分泌更高水平的IL-2和IFN-γ。Seahorse分析證實，Her2-IF1 CAR-T細胞的耗氧率顯著升高，表明其線粒體呼吸功能增強。令人意外的是，體內實驗結果與此相反。在過表達ATPIF1的CAR-T細胞中，盡管其在小鼠外周血和脾臟中的持久性（通過GFP+細胞百分比評估）顯著優于親本細胞，但其在抑制SKBR3移植瘤生長方面效果最差，腫瘤重量反而更大。在低氧條件（1% O2）下，Her2-IF1 CAR-T細胞的耗竭標志物（PD-1， LAG-3， TIM-3）表達顯著升高。
ATPIF1敲低在體外削弱HER2 CAR-T細胞功能，但在體內增強其抗腫瘤療效
與過表達的結果相對，ATPIF1敲低的Her2-shIF1 CAR-T細胞在體外表現出最慢的增殖速率、最低的腫瘤裂解活性和細胞因子分泌水平，其基礎呼吸和最大呼吸能力也顯著降低。然而，在荷瘤小鼠模型中，Her2-shIF1 CAR-T細胞卻展現出最強的腫瘤抑制效果，其腫瘤重量在所有治療組中最低，盡管在體外的功能表現最弱。這表明ATPIF1的表達對CAR-T細胞功能具有依賴于微環境的雙向調節作用。
ATPIF1通過影響線粒體功能和細胞生存適應低氧環境
機制探索發現，ATPIF1過表達會增加線粒體質量，但降低線粒體膜電位。在常氧條件下，ATPIF1敲低會增加細胞凋亡率；但在模擬腫瘤微環境的低氧條件下，ATPIF1敲低反而能顯著增強CAR-T細胞的生存率。免疫熒光分析顯示，Her2-shIF1 CAR-T細胞在實體瘤組織中的浸潤數量（CD3+細胞數/高倍視野）最多。臨床乳腺癌組織的多色免疫組化分析也證實，組織中ATPIF1的表達水平與CD3+T細胞的浸潤呈負相關，而與缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）的表達呈正相關。
ATPIF1敲低通過mPTP開放和mtDNA泄漏激活STING通路
進一步研究發現，ATPIF1敲低會增加線粒體通透性轉換孔的開放，并導致mtDNA（通過ND-1和D-loop水平評估）泄漏到細胞質中。泄漏的mtDNA隨后激活了干擾素基因刺激因子（STING）信號通路，表現為磷酸化STING（p-STING）、VDAC蛋白表達上調，以及下游效應分子IFI44和IFN-β的mRNA水平升高。當使用乙錠溴（EB）耗竭CAR-T細胞的mtDNA后，不同CAR-T細胞間p-STING和VDAC的蛋白表達差異消失，證實了mtDNA泄漏是激活STING通路的上游事件。
STING通路的激活是增強CAR-T細胞遷移和體內療效的關鍵
體外Transwell遷移實驗表明，在低氧條件下，Her2-shIF1 CAR-T細胞的遷移能力最強，而使用STING特異性抑制劑H151處理后，這種增強的遷移被顯著抑制。體內實驗進一步證實，H151處理可逆轉Her2-shIF1 CAR-T細胞在荷瘤小鼠中表現出的優越抗腫瘤療效，強調了STING信號通路在該調節過程中的核心作用。
討論
本研究系統闡明了ATPIF1在調控HER2靶向CAR-T細胞抗實體瘤功能中的關鍵作用及其矛盾性。在氧氣充足的體外環境中，ATPIF1過表達通過增加線粒體質量和氧化磷酸化能力，增強了CAR-T細胞的效應功能和持久性。然而，在實體瘤常見的低氧、營養匱乏的微環境中，ATPIF1的過度表達可能會因過度抑制ATP合酶而加劇線粒體功能障礙、細胞凋亡和耗竭，反而損害療效。
相反，適度的ATPIF1敲低在低氧環境下解除了對ATP合酶的抑制，使其能通過水解ATP來維持線粒體膜電位，從而提升了CAR-T細胞在惡劣腫瘤微環境中的生存能力。更重要的是，敲低ATPIF1誘發的mPTP開放和mtDNA泄漏，激活了STING依賴的先天性免疫通路，進而顯著增強了CAR-T細胞向腫瘤組織的遷移和浸潤能力，最終轉化為更強的體內抗腫瘤效果。
該研究揭示了一個重要的轉化醫學困境：在標準體外條件下（常氧、高營養）旨在增強CAR-T細胞代謝和功能的工程化策略，未必能在復雜的體內腫瘤微環境中產生預期的治療效果，有時甚至適得其反。ATPIF1及其下游的mtDNA-STING軸，為優化CAR-T細胞治療實體瘤提供了新的代謝和免疫調節靶點。未來的CAR-T細胞設計需要更精細地考慮腫瘤微環境的影響，并開發能夠動態響應微環境變化（如缺氧）的智能調控策略，以彌合體外性能與體內療效之間的差距。
