《Frontiers in Immunology》：Interaction between NKG2D and its ligands MICA/B activates the DAP12/SYK/p53/p21 axis to drive pulmonary fibrosis
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本研究揭示了免疫-纖維化交互在肺纖維化（PF）發病中的新機制。研究發現，在博來霉素（BLM）誘導的PF小鼠模型中，肺NK細胞表面的活化性受體NKG2D及其在成纖維細胞上的配體MICA/B表達顯著上調。通過NKG2D腺相關病毒（AAV5）過表達實驗證實，NKG2D的活化可觸發下游DAP12/SYK/p53/p21信號軸，進而誘導細胞衰老，從而加劇肺纖維化。重要的是，抗NKG2D抗體治療可有效緩解BLM誘導的纖維化進展，提示靶向NKG2D可能成為一種通過同時調節免疫-纖維化串擾和纖維化進程來治療PF的新策略。
摘要
肺纖維化（Pulmonary Fibrosis, PF）是一種進行性、致命的間質性肺疾病，其特點是肺組織不可逆的疤痕形成，最終導致呼吸衰竭和高死亡率。目前的治療藥物如尼達尼布和吡非尼酮只能有限地減緩疾病進展，且伴有明顯的副作用和經濟負擔。越來越多的證據表明，免疫-纖維化之間的相互作用參與了PF的發病機制，但其具體的分子機制尚不清楚。本研究旨在探討自然殺傷（Natural Killer, NK）細胞上的活化性受體NKG2D及其配體MICA/B介導的信號通路在PF中的作用，并評估靶向NKG2D的潛在治療價值。
引言
PF是一種死亡率很高的肺部疾病，確診后中位生存期僅2.5-3.5年。目前認為，PF并非單純的炎癥性疾病，而是一種由異常的免疫-纖維化串擾驅動的適應不良的修復過程。因此，靶向免疫微環境中的關鍵免疫細胞亞群可能成為一種新的治療策略。
NK細胞通過其細胞毒性和分泌細胞因子的功能，被認為是纖維化反應的關鍵調節者。NKG2D是NK細胞上的一種主要活化性受體，可識別應激誘導的配體，如MICA/B。有趣的是，近期證據表明，NKG2D及其信號通路可能參與調節細胞衰老，而衰老細胞是纖維化組織中的重要驅動因素。本研究旨在填補NKG2D在PF中調控細胞衰老機制的知識空白，并驗證靶向NKG2D的單克隆抗體是否是一種有前景的免疫治療策略。
方法
1. PF小鼠模型的構建與NKG2D-MICA/B表達檢測
研究使用博來霉素（Bleomycin, BLM）誘導的PF小鼠模型。通過Western印跡、RT-qPCR和流式細胞術檢測肺組織中NKG2D及其配體（小鼠中為H60c和RAET1L）的表達。通過檢測纖維連接蛋白和羥脯氨酸表達水平來驗證PF模型是否構建成功。
2. 肺成纖維細胞與NK細胞的相互作用研究
通過體外共培養系統研究NK細胞與成纖維細胞的相互作用。用白細胞介素-2（IL-2）激活人NK-92MI細胞，或將其與K562細胞共培養以增強NK細胞效應功能。之后，將激活的NK細胞與人肺成纖維細胞（MRC-5）或經轉化生長因子-β1（TGF-β1）預處理的胎兒肺成纖維細胞（HFL-1）共培養。通過流式細胞術分析NKG2D表達，通過酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測干擾素-γ（IFN-γ）的分泌，通過乳酸脫氫酶（LDH）釋放試驗檢測細胞溶解活性，并通過Western印跡和RT-qPCR分析成纖維細胞中NKG2D配體MICB及纖維化標志物（如纖維連接蛋白和TGF-β1）的表達。
3. NKG2D-AAV5小鼠模型的構建與纖維化指標檢測
利用腺相關病毒5型（AAV5）介導的基因遞送系統，在小鼠肺內過表達NKG2D。將雄性C57BL/6小鼠隨機分為對照組、BLM組、AAV5-EGFP組、AAV5-EGFP+BLM組、NKG2D-AAV5組和NKG2D-AAV5+BLM組。AAV5病毒于第0天氣管內給藥，BLM于第14天給藥。通過微型CT成像、組織學染色（蘇木精-伊紅（HE）染色和馬松三色染色）和Western印跡（檢測膠原蛋白I型和纖維連接蛋白）等方法評估肺纖維化的嚴重程度、炎癥浸潤和膠原沉積。
4. NKG2D-AAV5誘導的小鼠細胞衰老機制探索
通過免疫熒光（IF）共定位和免疫共沉淀（Co-IP）分析NKG2D與接頭蛋白DAP12的相互作用。通過免疫組織化學（IHC）和Western印跡檢測下游信號分子SYK、磷酸化p53（p-p53）和p21的表達水平，以闡明NKG2D過表達是否通過DAP12-SYK-p53-p21軸誘導細胞衰老。
5. NKG2D抗體干預PF小鼠驗證NKG2D在PF中的作用
在BLM誘導的PF小鼠模型中，通過腹腔注射抗NKG2D單克隆抗體進行治療，并以吡非尼酮（PFD）作為陽性對照。通過上述的影像學、組織病理學和分子生物學方法評估治療效果。同時，在體外實驗中，用SYK抑制劑R406處理過表達p53的HEK293T細胞，通過Western印跡檢測p53蛋白水平的變化，以驗證SYK對p53的調控作用。
結果
1. 肺NK細胞上NKG2D的上調是纖維化肺病理的特征
在BLM誘導的PF小鼠肺組織中，纖維連接蛋白和羥脯氨酸的表達均顯著上調，表明PF模型構建成功。與對照組相比，模型組小鼠肺組織中NKG2D及其配體在mRNA和蛋白水平上均顯著升高。流式細胞術分析進一步證實，纖維化肺組織中NKG2D陽性的NK細胞數量顯著增加。這些數據表明，在PF發病過程中，NKG2D-MICA/B軸發生失調。
2. NKG2D介導的串擾增強了促纖維化的NK細胞-成纖維細胞相互作用
體外實驗表明，經K562細胞刺激后，NK細胞的IFN-γ分泌、LDH釋放和NKG2D表達均顯著增加。當激活的NK細胞與MICA轉染的MRC-5成纖維細胞共培養時，NK細胞表面的NKG2D表達進一步增強。同樣，激活的NK細胞與HFL-1成纖維細胞共培養后，成纖維細胞上NKG2D配體MICB的表達增加，同時促纖維化標志物纖維連接蛋白和TGF-β1的表達也上調。這些結果提示，通過NKG2D-MICA/B軸進行的雙向NK-成纖維細胞通訊可能驅動纖維化進展。
3. NKG2D-AAV5誘導PF模型小鼠的纖維化進展
在動物模型研究中，與單獨BLM處理組相比，NKG2D-AAV5與BLM聯合處理組的小鼠表現出更嚴重的肺纖維化。微型CT掃描和馬松染色顯示，聯合組的纖維化評分顯著更高。HE染色證實聯合組炎癥浸潤加劇。支氣管肺泡灌洗液（BALF）細胞計數在聯合組也顯著增加。Western印跡分析顯示，聯合組肺組織中膠原蛋白I型和纖維連接蛋白的表達水平顯著升高。這些結果共同表明，通過AAV5高效遞送并特異性表達的NKG2D，與BLM誘導的損傷協同作用，通過多種病理級聯反應加速了PF。
4. NKG2D過表達通過DAP12-SYK軸驅動纖維化并誘導細胞衰老
機制研究方面，免疫共沉淀實驗證實NKG2D與接頭蛋白DAP12之間存在相互作用。在體內，NKG2D-AAV5+BLM聯合組肺組織中DAP12蛋白的表達顯著增加。下游信號分析顯示，聯合組的脾酪氨酸激酶（SYK）表達上調，同時衰老相關標志物磷酸化p53（Ser15位點）和p21的水平也顯著增加。這表明NKG2D過表達通過激活DAP12-SYK-p53-p21細胞衰老軸加速了PF。在體外細胞實驗中，SYK抑制劑R406處理可降低過表達p53的HEK293T細胞中p53蛋白的水平，提示SYK活性可能正向調控p53表達。
5. NKG2D的治療性阻斷可減輕BLM誘導的肺纖維化
在BLM誘導的PF小鼠模型中，使用抗NKG2D抗體進行治療能顯著改善疾病進展。微型CT定量顯示，與模型組相比，抗體治療組的纖維化病變體積減少了約40%。組織病理學評估顯示，抗體治療減輕了肺部炎癥和膠原沉積。Western印跡也證實，治療組肺組織纖維化標志物纖維連接蛋白的表達顯著下調。對下游信號分子的檢測發現，抗NKG2D抗體治療可下調肺組織中NKG2D、DAP12、SYK和p21的表達。這表明抗體治療有效阻斷了NKG2D-DAP12-SYK-p53信號軸的活化。
討論
本研究闡明了NKG2D-MICA/B軸在PF發病機制中的關鍵作用，揭示了其在免疫激活和纖維化進展中的雙重功能。研究發現，在PF中，NKG2D通過DAP12-SYK依賴性機制驅動纖維生成，并促進細胞衰老，這與它在其他器官（如肝臟、腎臟）纖維化中的保護性作用形成鮮明對比。這種功能差異可能源于接頭蛋白的使用、局部免疫微環境和配體多樣性等因素。本研究首次揭示了NKG2D-DAP12-SYK-p53信號軸在PF中的重要作用，為理解免疫-纖維化相互作用提供了新視角。
研究也存在一些局限性，例如使用的單劑量BLM模型是一種急性、可自愈的肺損傷模型，不能完全模擬人類PF的慢性進行性病程；抗NKG2D抗體的療效評估僅使用了單一劑量方案；此外，p53-p21通路的激活發生在具體哪種細胞類型中（成纖維細胞、NK細胞或其他肺細胞亞群）尚未闡明。未來的研究需要在慢性纖維化或衰老動物模型中進一步驗證該通路的持續激活機制，并利用細胞特異性操作技術闡明其細胞定位，同時優化NKG2D靶向干預策略，為PF治療提供新的免疫調控方法。
結論
在BLM誘導的小鼠模型中，NKG2D-MICA/B軸可能通過DAP12-SYK-p53-p21介導的細胞衰老途徑促進肺纖維化。NKG2D的過表達會加劇纖維化反應，而阻斷NKG2D則可顯著減輕病理變化。NKG2D阻斷的治療效果在該模型中似乎與現有藥物吡非尼酮不同且更顯著，這提示其可能具有同時靶向免疫激活和細胞衰老的雙重機制。這些臨床前研究結果表明，NKG2D通路可能是一個新型的免疫-纖維化調控靶點。
