本研究報道了一種創新的、通過緩解細胞耗竭與衰老來增強CAR-T細胞實體瘤免疫治療效能的策略，其核心是開發了超小型鐵-姜黃素（Fe-Cur）免疫調節納米顆粒。

CAR-T細胞免疫療法在血液系統惡性腫瘤中取得了激動人心的成功，但在實體瘤中的療效相對有限。實體瘤中復雜的抑制性因素，如細胞擴增能力受抑制、浸潤能力有限以及嚴重的細胞耗竭和衰老，深刻損害了CAR-T細胞的細胞毒性。CAR-T細胞耗竭可由持續的抗原刺激以及抑制性受體的持續表達引起。此外，復雜且具有抑制性的腫瘤微環境（TME）——以低pH值、缺氧和豐富的抑制性免疫細胞為特征——是CAR-T細胞對抗實體瘤成功的另一限制因素。浸潤到實體瘤中的CAR-T細胞會遇到一個深度免疫抑制的微環境，這個環境共同損害T細胞功能，促進耗竭，并加速CAR-T細胞的衰老。

免疫衰老，特別是T細胞衰老，以先天性和適應性免疫應答的退化為特征。接近壽命終點時，T細胞可能進入衰老狀態，通常以細胞周期停滯和CD57、KLRG1等標志物表達升高為標志。衰老的T細胞以CD27和CD28等共刺激分子的丟失，以及p53、p21和γ-H2AX等DNA損傷和細胞周期調節因子表達升高為特征。耗竭的T細胞則逐漸失去產生IL-21、腫瘤壞死因子和干擾素-γ的能力，并喪失有效的增殖和殺傷能力。

姜黃素作為一種傳統的天然藥物成分，可通過激活線粒體凋亡途徑以及線粒體膜電位喪失來誘導腫瘤細胞凋亡。此外，姜黃素還可調節記憶T細胞分化，并增強T細胞對抗癌細胞的細胞毒活性，同時抑制調節性T細胞和免疫檢查點分子的表達。盡管姜黃素具有一定的抗腫瘤活性，但它仍存在水分散性差、半衰期短和靶向能力低等缺陷。因此，利用先進方法開發多功能姜黃素納米療法，同時改善TME和促進CAR-T細胞功能，將是一種有前景的治療實體瘤策略。

通過姜黃素與Fe³⁺之間簡單的配位反應合成了超小型Fe-Cur納米顆粒。透射電子顯微鏡結果顯示，Fe-Cur納米顆粒約為5納米，尺寸超小且均勻性良好。MRI成像特性表明，Fe-Cur納米顆粒具有優異的T₁加權MRI成像能力。與純姜黃素的良好結晶性相比，Fe-Cur納米顆粒顯示出無定形相，表明姜黃素與Fe³⁺之間發生了配位反應。X射線光電子能譜分析確定了Fe-Cur納米顆粒中Fe²⁺和Fe³⁺的存在。傅里葉變換紅外光譜表征顯示，姜黃素與Fe-Cur之間的峰高度一致。動態光散射表征表明，在水環境中，尺寸分布主要在16納米左右，這比TEM尺寸大是由于水合層的作用。Fe-Cur的Zeta電位值約為+15.3毫伏，較大的正電位賦予其優異的分散性和穩定性，并使其能夠通過靜電吸引與帶負電的CAR-T細胞膜有效結合。

用不同濃度的FC納米顆粒處理小鼠肝癌細胞系Huh7和小鼠乳腺癌細胞系4T1。結果表明，FC納米顆粒通過上調促凋亡標記物（Bax和caspase-3）同時下調抗凋亡因子（Bcl-2和Bcl-xL），顯著增加了腫瘤細胞死亡率。流式細胞術分析表明，FC納米顆粒處理后，凋亡細胞呈劑量依賴性增加，在50微克/毫升時效果最明顯。實時監測數據顯示，濃度為50微克/毫升的FC納米顆粒抑制了Huh7和4T1細胞的生長。此外，FC納米顆粒還損害了腫瘤細胞線粒體膜電位的完整性。這些發現共同證明，FC納米顆粒以劑量依賴的方式誘導癌細胞凋亡。

研究設計了靶向小鼠FAP的CAR-T細胞（稱為FAP CAR）和靶向人HER2的CAR-T細胞。隨后，將慢病毒載體轉導至供體來源的T細胞或小鼠脾臟來源的T細胞中。轉導后2-3天，根據His標簽表達評估轉導效率，FAP CAR-T細胞上His標簽的表達率為30%-40%，HER2 CAR-T細胞上為40%-50%，表明兩種CAR構建體均以一致的轉導效率成功轉導至原代T細胞中。進一步評估了FAP CAR-T細胞的細胞毒性，其對FAP陽性靶細胞表現出有效的劑量依賴性殺傷。此外，與未轉導的T細胞相比，FAP CAR-T細胞中干擾素-γ和顆粒酶B的分泌明顯增加。HER2 CAR-T細胞在效應細胞與靶細胞比例為1:1和2:1時，有效抑制了H1299細胞的增殖。

CCK-8結果顯示，FC納米顆粒不抑制T細胞的增殖，并且對FAP CAR-T細胞在測試濃度范圍內沒有明顯的細胞毒性。RNA-Seq分析顯示，用5微克/毫升FC納米顆粒處理的人HER2 CAR-T細胞中，Bcl-2家族蛋白上調，特別是Bcl-2、Bcl-2L1、Bcl-2L2和Bcl-2L11。細胞凋亡通路在FC納米顆粒處理的HER2 CAR-T細胞中發生改變，表現為Bcl-2上調和caspase-3表達下調。出乎意料的是，FC納米顆粒顯著增強了CAR-T細胞對腫瘤細胞的細胞毒性。綜上所述，FC納米顆粒改善了CAR-T細胞的存活和抗腫瘤活性。

KEGG通路分析顯示，在用FC納米顆粒孵育后，人HER2 CAR-T細胞中的p53信號通路被顯著調節。GSEA和熱圖結果也表明，用或不用FC納米顆粒處理的CAR-T細胞中，與p53信號通路相關的基因注釋存在差異。同時，在FC納米顆粒處理的HER2 CAR-T細胞中，p53和磷酸化p53呈劑量依賴性下調。體外殺傷實驗表明，FC納米顆粒增強了CAR-T細胞的腫瘤殺傷能力，但當FC納米顆粒處理的CAR-T細胞與p53激動劑Nutlin-3a共同給藥時，這種增強作用被減弱，這表明FC納米顆粒通過抑制p53表達來增強CAR-T細胞的細胞毒性。

為了研究FC納米顆粒是否影響CAR-T細胞衰老，分析了FC處理的CAR-T細胞中衰老相關標志物p21和γ-H2AX。結果顯示，FC納米顆粒處理后，p53、p21和γ-H2AX水平顯著降低。RNA-Seq分析揭示了FC處理與未處理的CAR-T細胞之間不同的細胞衰老信號通路，包括衰老相關基因KLRG1和TIGIT的差異表達。暴露于p53激動劑的CAR-T細胞表現出γ-H2AX水平升高，表明DNA損傷反應增強。同樣，FC納米顆粒處理顯著提高了CAR-T細胞中衰老相關標志物CD27的水平，而Nutlin-3a則下調了CD27的表達。同時，FC納米顆粒處理顯著下調了CAR-T細胞中衰老相關標志物CD57和KLRG1的表達，而補充Nutlin-3a則逆轉了這種效應。此外，在將過表達p53的CAR-T細胞與FC納米顆粒共培養后，觀察到納米顆粒挽救了p53過表達誘導的衰老。總體而言，研究證明FC納米顆粒可減輕CAR-T細胞衰老，從而增強其細胞毒效力。

鑒于FC納米顆粒介導的CAR-T細胞功能和細胞毒性的顯著增強，隨后評估了FC納米顆粒和CAR-T細胞在體內的聯合抗腫瘤功效。對皮下注射了Hepa1-6 FAP細胞的輻照小鼠，分別單獨給予CAR-T細胞或FC納米顆粒與CAR-T細胞的組合。結果顯示，單獨使用CAR-T細胞可顯著抑制腫瘤生長。值得注意的是，與CAR-T細胞單藥治療相比，CAR-T細胞與FC納米顆粒的組合顯示出更明顯的腫瘤體積減小。小鼠的體重在整個研究過程中被密切監測，治療組之間沒有觀察到顯著差異。此外，接受CAR-T細胞和FC納米顆粒聯合治療的荷瘤小鼠，其生存期比單獨接受任何一種治療的小鼠顯著延長。在平行實驗中，從FAP CAR-T加FC納米顆粒組小鼠收獲的腫瘤，與其他治療組相比，腫瘤體積顯著減小。

為了評估FC納米顆粒的腫瘤浸潤情況，在給予CAR-T細胞和/或FC納米顆粒后6小時進行了MR成像。定量分析顯示，與對照組相比，僅FC組和FC+CAR-T治療組的腫瘤部位MR信號強度顯著增強。通過H&E和TUNEL染色評估腫瘤組織切片中的壞死和凋亡。這些發現共同表明，CAR-T細胞和FC納米顆粒的組合可協同增強抗腫瘤功效，并促進比單獨使用FC納米顆粒更強大的腫瘤浸潤。

鑒于細胞因子釋放綜合征和免疫效應細胞相關神經毒性綜合征是CAR-T細胞療法公認的兩種主要毒性，研究建立了一個高劑量CAR-T細胞給藥模型，以系統評估CAR-T細胞和FC納米顆粒的安全性。組織病理學檢查顯示，所有治療組的心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟或腦組織均未出現顯著的形態學異常，表明CAR-T細胞和FC納米顆粒的組合未在主要器官中引起可檢測的毒性。此外，評估了外周血中CRS相關細胞因子的水平，結果表明FC納米顆粒有效減少了它們的分泌。同時，評估了FC納米顆粒對各小鼠器官中免疫細胞的影響。結果表明，FC納米顆粒處理并未導致所有檢查組織中這些細胞頻率的顯著改變。

T細胞耗竭會損害CAR-T細胞的持續性和抗腫瘤功效，是實現有效治療反應的主要障礙。基于上述FC納米顆粒減輕CAR-T細胞衰老的發現，接下來研究了它們對T細胞耗竭的影響。對關鍵耗竭標志物（PD-1、Tim-3、CTLA-4和LAG-3）的體外分析顯示，FC納米顆粒處理顯著降低了人HER2特異性CAR-T細胞中這些免疫檢查點的表達，證明了其緩解T細胞耗竭的能力。此外，qPCR分析顯示，與未使用FC納米顆粒的CAR-T細胞相比，使用FC納米顆粒的CAR-T細胞中關鍵耗竭相關轉錄因子如T-bet和Blimp-1下調。定量分析顯示，與對照組相比，FC納米顆粒處理的CAR-T細胞中耗竭相關的TOX和TOX2轉錄本表達顯著降低。這些發現共同表明，FC納米顆粒修飾可在體外條件下使CAR-T細胞保持低耗竭表型。

為了評估FC納米顆粒對人CAR-T細胞抗腫瘤活性的增強程度，建立了人肺癌細胞系荷瘤小鼠模型。縱向腫瘤監測表明，CAR-T細胞和FC納米顆粒的組合實現了更優的腫瘤生長抑制，并顯著延長了中位生存期。在平行實驗中，聯合治療組提取的腫瘤明顯小于其他組。此外，CAR-T加FC納米顆粒組在所有治療中表現出最強的腫瘤細胞毒性。為了研究體內CAR-T細胞的耗竭情況，使用流式細胞術分析了腫瘤中浸潤的CAR-T細胞表面的耗竭相關標志物。結果發現，FC納米顆粒抑制了腫瘤中CAR-T細胞的耗竭。這些數據表明，FC納米顆粒在體內協同增強了CAR-T細胞的抗腫瘤功效，同時防止了它們的耗竭。

記憶T細胞在維持抗腫瘤免疫中起著關鍵作用。流式細胞術分析顯示，與FC納米顆粒共培養的CAR-T細胞中，關鍵干細胞樣記憶T細胞標志物CCR7上調。研究比較了用或不用FC納米顆粒刺激的HER2 CAR-T細胞的CD4⁺: CD8⁺比率，發現FC納米顆粒顯著增強了CAR-T細胞的CD4⁺亞群。根據CD45RA和CD62L的表達，T細胞可大致分為四個表型亞群。其中，初始T細胞和中央記憶T細胞比效應記憶T細胞表現出更強的增殖能力和更少的分化狀態。為了評估在存在或不存在FC納米顆粒的情況下，長時間刺激對人HER2 CAR-T細胞的潛在益處，通過流式細胞術分析了定義的亞群。值得注意的是，與FC納米顆粒共培養的CAR-T細胞顯示出T_CM細胞的顯著富集。隨后的qPCR分析顯示，FC納米顆粒刺激的CAR-T細胞中，TCF7和LEF1——控制記憶干細胞特性和T_CM形成的關鍵轉錄因子——的表達相對于對照組上調。GO富集分析顯示，記憶相關信號通路在T細胞+FC組中被顯著激活，CCR7的表達升高證明了這一點。這些數據證實，FC納米顆粒能使CAR-T細胞保持T_CM表型，表明CAR-T+FC療法可能具有持續的抗腫瘤效力。

熱圖分析表明，T細胞增殖和CD4⁺T細胞增殖相關的信號通路被激活。為了進一步評估FC納米顆粒對CAR-T細胞的增殖效應，進行了流式細胞術以評估增殖標志物CD25和Ki67的表達。結果表明，與FC納米顆粒孵育的HER2 CAR-T細胞上增殖標志物CD25和Ki67的表達增強。在CAR-T細胞與FC納米顆粒共培養中觀察到CD27和CD28的表達升高，這表明FC納米顆粒增強了T細胞/CAR-T細胞的增殖能力。總之，這些結果表明，FC納米顆粒共培養使CAR-T細胞保持了更優的表型特征。

盡管FC納米顆粒已被報道可清除細胞內活性氧并協同減輕某些慢性疾病的炎癥，但其潛在的抗腫瘤作用和在體內調節TME的能力在很大程度上仍未得到探索。FC納米顆粒改善了CAR-T細胞的細胞毒性、增殖和T_CM表型，并抑制了耗竭。在確立了CAR-T/FC納米顆粒聯合治療的協同抗腫瘤免疫后，接下來評估了FC納米顆粒是否能夠重塑TME以增強CAR-T細胞在體內的細胞毒性，同時評估旁觀者效應。

首先，建立了4T1-FAP荷瘤小鼠模型。在給予FAP CAR-T細胞后，通過流式細胞術分析了腫瘤浸潤免疫細胞。結果表明，與PBS對照組相比，FC納米顆粒和FAP CAR-T細胞處理均顯著增強了腫瘤組織內內源性T細胞的浸潤。正如預期的那樣，CAR-T+FC聯合組表現出最顯著的內源性T細胞浸潤。在腫瘤微環境中，巨噬細胞是一個關鍵的細胞成分，通常與不良的臨床結果相關。在免疫抑制性TME群體中，腫瘤相關巨噬細胞表現出代謝重編程，驅動其極化為不同的M1和M2亞型。雖然M2巨噬細胞通過免疫抑制機制促進腫瘤進展，但M1巨噬細胞顯示出促炎和抗腫瘤特性。在這項研究中，在FAP CAR-T+FC輸注組中觀察到M1巨噬細胞亞群比例升高，M2巨噬細胞亞群比例降低。

RNA-seq分析顯示，FC納米顆粒處理激活了T細胞中的趨化因子信號通路，多種趨化因子受體（包括CCR1、CXCR1、CXCR2、CXCR4、CXCR5和CXCR6）的顯著上調證明了這一點。為了評估FC納米顆粒處理的CAR-T細胞的腫瘤浸潤能力，對腫瘤切片進行了免疫組織化學染色。分析表明，FC納米顆粒處理后，CAR-T細胞在腫瘤部位的積累和局部聚集顯著增強。為了確定TME中缺氧的緩解是否可以增強CAR-T細胞浸潤，除了評估趨化因子受體表達外，還評估了瘤內缺氧狀況。用CAR-T細胞加FC納米顆粒處理的腫瘤組織中，缺氧標志物HIF-1α和內皮標志物CD31的表達顯著降低，證明FC納米顆粒在體內有效改善了缺氧的腫瘤微環境。此外，檢測了腫瘤組織的活性氧，發現CAR-T+FC組中活性氧升高。

綜上所述，FC納米顆粒能夠歸巢到腫瘤組織，并通過緩解缺氧來重塑TME。這一過程促進了CAR-T細胞和內源性免疫細胞的浸潤，并重編程了TAMs，從而協同增強了CAR-T細胞療法的抗腫瘤功效。

總之，這項工作展示了一種新型的Fe-Cur納米顆粒偶聯CAR-T細胞策略，通過減輕CAR-T細胞耗竭和衰老來增強實體瘤免疫治療。作為原理驗證，合成了尺寸均勻為5納米、帶大量正電荷的超小型Fe-Cur納米顆粒，其可通過靜電吸引與CAR-T細胞緊密結合，形成Fe-Cur武裝的CAR-T細胞偶聯物。Fe-Cur納米顆粒通過抑制p53通路，顯示出能有效增強CAR-T細胞的腫瘤殺傷能力。此外，Fe-Cur納米顆粒可通過減輕CAR-T細胞耗竭和衰老，顯著促進抗腫瘤能力。體內實體瘤實驗證明，Fe-Cur納米顆粒與CAR-T細胞協同作用，顯著限制了腫瘤生長并延長了生存時間。此外，Fe-Cur納米顆粒能夠顯著緩解抑制性腫瘤微環境，包括增強CAR-T細胞和內源性免疫細胞浸潤以及重編程TAMs，這進一步減輕了CAR-T細胞的耗竭和衰老。基于這些發現，這項工作系統而詳細地闡明了一種創新的、基于Fe-Cur納米顆粒偶聯CAR-T細胞的免疫治療策略，用于MRI引導下的實體瘤治療，可作為未來臨床技術轉化和應用的適應性轉移細胞療法的指導性延伸。