《The Journal of Nutritional Biochemistry》：Curdione alleviates renal fibrosis through Fblim1-dependent inhibition of the TGF-β1/Smad3 signaling pathway
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姜黃素通過直接靶向Fblim1抑制TGF-β/Smad3通路發揮抗腎纖維化作用。研究在UUO小鼠和TGF-β1刺激的TCMK1細胞中證實，姜黃素劑量依賴性抑制α-SMA、纖維連接蛋白和I型膠原表達，同時抑制Fblim1表達及Smad2/3磷酸化。分子實驗證實姜黃素與Fblim1直接結合（-6.7 kcal/mol），過表達Fblim1逆轉姜黃素療效。研究為CKD治療提供新候選藥物。
李倩倩|倪玉芳|李照陽|鄒圓霞|郭懷英|王紅蓮|張瓊|王莉|李建軍
中國瀘州西南醫科大學附屬中醫院中西醫結合醫學研究中心
摘要
慢性腎臟病（CKD）會不可避免地通過腎小管間質纖維化進展為終末期腎病（ESRD），這一過程主要由轉化生長因子-β（TGF-β）/SMAD家族成員3（Smad3）信號通路驅動。雖然姜黃根中的主要倍半萜類化合物姜黃酮具有抗纖維化活性，但其具體在腎纖維化中的機制尚不清楚。在本研究中，我們使用單側輸尿管阻塞（UUO）小鼠模型和TGF-β1刺激的腎小管上皮細胞（TCMK1）模型探討了姜黃酮的保護作用。結果發現，25和100毫克/千克劑量的姜黃酮顯著減輕了UUO引起的腎損傷和腎小管壞死，抑制了損傷標志物腎損傷分子-1（KIM-1），并劑量依賴性地抑制了α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、纖維連接蛋白（FN）和膠原蛋白I的表達。在TGF-β1刺激的TCMK1細胞中，姜黃酮也防止了纖維化形態變化，并抑制了促纖維化標志物的上調。機制上，姜黃酮在體內和體外均抑制了Filamin結合LIM蛋白1（Fblim1）的表達以及Smad2/3的磷酸化。關鍵的是，通過超聲微泡介導的質粒遞送在體內過表達Fblim1，并在體外得到驗證，顯著削弱了姜黃酮的抗纖維化效果并恢復了p-Smad3的水平。此外，分子對接預測其具有強烈的結合親和力（-6.7 kcal/mol），而細胞熱位移測定（CETSA）和藥物親和力響應靶標穩定性（DARTS）實驗證實姜黃酮直接與Fblim1結合，增強了其分子穩定性�？傊�，本研究從組織、細胞和分子層面提供了證據，表明姜黃酮通過直接靶向Fblim1，從而功能性地抑制TGF-β1/Smad3信號通路，發揮強大的抗纖維化和腎保護作用。這些發現使姜黃酮成為治療CKD的有希望的天然候選藥物。
引言
慢性腎臟病（CKD）是一個嚴重的全球公共衛生問題，其特征是腎功能進行性和不可逆的下降，最終導致終末期腎�。‥SRD）[1]。全球約有10%的人口受到CKD的影響，它是主要的死亡原因之一，與心血管風險增加和健康相關生活質量顯著下降密切相關[1]。CKD進展的病理標志和最終決定因素是腎小管間質纖維化，其嚴重程度與功能喪失直接相關[2,3]。轉化生長因子-β（TGF-β）/SMAD家族成員3（Smad3）信號通路是纖維化重塑的主要、非冗余的驅動因素[4]。具體而言，Smad3的激活是這一過程的核心；有充分證據表明，其基因敲除可提供強大的抗纖維化保護，而其持續激活會加速多種模型中的疾病進展[5,6]。因此，TGF-β/Smad3軸被廣泛認為是阻止CKD的有效治療靶點。盡管有這些強有力的證據，但仍然迫切需要能夠安全且特異性地干擾這一關鍵通路的臨床有效抗纖維化藥物。
最近的研究越來越多地表明，天然化合物可以通過協調調節炎癥、氧化應激和纖維化相關的關鍵信號通路來預防CKD。例如，含有阿魏酸的咖啡酸被證明可以通過抑制芳基烴受體（AHR）的核轉位并調節下游核因子-κB（NF-κB）/核因子紅系2相關因子2（Nrf2）信號通路，從而減輕腺嘌呤誘導的大鼠的CKD[7]。類似地，Geniposidic酸通過調節AHR介導的NF-κB/Nrf2通路，減輕了慢性腎小管間質腎病，降低了氧化應激并改善了腎功能[8]。Barleriside A作為AHR拮抗劑，通過同時減輕氧化應激和炎癥保護足細胞，進一步突顯了針對AHR信號通路在CKD中的治療價值[9]。除了AHR相關的機制外，黃酮類化合物Fisetin通過特異性抑制酰基輔酶A合成酶長鏈家族成員4（ACSL4）介導的腎小管鐵死亡，從而減少腎小管損傷、炎癥反應和纖維化腎臟中的細胞外基質沉積[10]�？傮w而言，這些研究表明天然化合物可以通過多種互補的分子通路干預CKD的進展，為探索類似的生物活性物質在腎纖維化中的應用提供了有力的依據。
鑒于傳統藥物開發的有限成功，天然產物為新型治療藥物的發現提供了豐富且結構多樣的資源。多項研究表明，這些天然化合物可以通過抑制TGF-β1/Smad信號通路來減緩CKD的進展，這是腎纖維化的主要驅動因素[11]。姜黃酮是從姜黃根中提取的主要倍半萜類化合物[12]，先前已在多種病理模型中顯示出有希望的作用，包括對局灶性腦缺血-再灌注損傷的保護[13]，以及對抗氧化應激[14]、細胞凋亡[15]和鐵死亡[16]的強大效果，例如在心肌梗死或心臟毒性模型中。重要的是，姜黃酮也被報道在肺部[17]和肝臟[18]纖維化模型中具有抗纖維化活性。這些發現強烈表明其治療潛力擴展到了病理組織重塑。然而，盡管有這些關于其在其他器官中抗纖維化能力的累積證據，姜黃酮在腎纖維化中的具體作用——包括其精確的分子靶點和下游機制——尚未得到系統闡明。解決這一空白對于驗證姜黃酮作為CKD的有效抗纖維化候選藥物至關重要。
最近的研究強調了Filamin結合LIM蛋白1（Fblim1）是一個被低估但可能對細胞外基質動態和TGF-β信號通路具有關鍵調節作用的因子[19,20]。支持這一聯系的一項最新研究表明，CAF（癌相關成纖維細胞）中Fblim1陽性的亞群與TGF-β表達增加、間充質標志物水平升高和免疫抑制性腫瘤微環境高度相關，表明Fblim1與TGF-β/Smad通路之間存在密切關聯。此外，對肝纖維化的研究顯示，敲低Fblim1顯著抑制了TGF-β/Smad調控的肝纖維化。
鑒于姜黃酮之前已被證實參與調節TGF-β/Smad通路[17]，而Fblim1也被驗證為該通路的調節因子[20]，我們假設姜黃酮可能通過調節Fblim1的表達和隨后的TGF-β/Smad信號通路來發揮其抗纖維化作用。為了驗證這一點，我們首先在單側輸尿管阻塞（UUO）小鼠模型和體外模型中確認了姜黃酮對腎纖維化的保護作用。在此基礎上，我們發現姜黃酮顯著改變了Fblim1的表達，并通過細胞熱位移測定（CETSA）和藥物親和力響應靶標穩定性（DARTS）實驗確認了姜黃酮與Fblim1之間的直接結合。為了明確姜黃酮與Fblim1之間的功能關系，我們在體內和體外過表達Fblim1進行了拯救實驗，以評估姜黃酮抗纖維化作用的機制。
材料
姜黃酮（Cur，目錄號CFN99146，純度≥98%，通過HPLC驗證）購自ChemFaces有限公司（中國武漢）。Pirfenidone（PFD，目錄號P129335）購自Aladdin生化技術有限公司（中國上海）。實驗中使用的所有生化試劑均為分析級。
質粒構建和克隆
使用PCR聚合酶（目錄號P505，Vazyme，中國）擴增了Fblim1的編碼序列（CDS）。然后使用克隆試劑盒（目錄號C115，Vazyme，中國）將此Fblim1 CDS無縫克隆到兩個載體中。
姜黃酮在UUO模型中減輕UUO引起的腎小管損傷并抑制KIM-1表達
為了評估姜黃酮的潛在腎保護作用，首先對其化學結構進行了表征（圖1A），然后通過UUO在小鼠中建立了急性腎損傷模型。使用H&E染色進行的組織病理學分析顯示，與假手術對照組相比，UUO小鼠的腎損傷嚴重（圖1B, 1D）。這種損傷表現為明顯的腎小管擴張、結構紊亂、腎小管細胞壞死顯著增加等。
討論
慢性腎臟病的進展最終導致終末期腎病，腎小管間質纖維化是與其功能喪失直接相關的病理標志[28]。TGF-β/Smad信號通路是這種纖維化重塑的主要驅動因素，其持續激活是疾病加速的核心[4,29,30]。因此，靶向TGF-β/Smad3軸仍然是阻止CKD的有效策略。姜黃酮是從姜黃根中提取的主要倍半萜類化合物。
結論
總之，本研究系統地闡明了天然倍半萜類化合物姜黃酮在腎纖維化治療中的獨特作用機制。我們的工作明確證明了姜黃酮通過直接結合并抑制Fblim1，有效阻斷了核心的TGF-β/Smad3纖維化信號通路。未來的研究應關注在更大動物模型或多種腎病理中的長期療效和藥代動力學，以加速轉化研究。
倫理批準聲明
所有實驗程序均獲得了西南醫科大學動物倫理委員會的批準（批準編號20240715-041）。
作者貢獻聲明
李倩倩：撰寫——初稿，監督。
倪玉芳：數據可視化，項目管理。
李照陽：數據可視化。
鄒圓霞：方法學，正式分析。
郭懷英：軟件，方法學。
王紅蓮：撰寫——初稿，監督。
張瓊：撰寫——審閱與編輯，資源協調。
王莉：撰寫——審閱與編輯，監督。
李建軍：撰寫——審閱與編輯，監督，概念構思。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文所述的工作。
致謝
本研究得到了國家自然科學基金（編號82104665）、四川省科技計劃（編號2026NSFSC0638）、瀘州市人民政府與西南醫科大學的聯合項目（編號2024LZXNYKDJ020）以及西南醫科大學的資助計劃（編號2024ZXYZX05）的支持。
