《The Journal of Nutritional Biochemistry》：Subacute ruminal acidosis induces inflammation, autophagy, and apoptosis by disrupting Ca2? homeostasis via STIM1/ORAI1 upregulation in mammary gland tissues
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高濃度飼料通過上調STIM1/ORAI1激活鈣信號通路，導致綿羊乳腺組織炎癥、自噬和凋亡。實驗顯示高濃度組乳腺組織Ca2?含量顯著升高，通過CaMKKβ-NF-κB通路促進炎癥因子表達，同時激活AMPK-mTOR通路誘導自噬，并上調凋亡相關蛋白表達。
孟美娟|任旭然|李學瑞|周善東|沈向珍|常光軍
中國江蘇省南京市南京農業大學獸醫學院，郵編210095
摘要
亞急性瘤胃酸中毒（SARA）是反芻動物中常見的代謝紊亂疾病，可引發乳腺炎，而鈣離子（Ca2?）平衡的破壞與乳腺疾病密切相關。本研究旨在通過探討鈣離子信號通路在SARA引發的乳腺損傷中的作用，包括其對炎癥、自噬和細胞凋亡的調控機制。實驗中，我們給Hu羊喂食高濃度（HC，70%精料）日糧（pH值低于5.6持續超過3小時），持續56天。實驗結束后收集了動物的血液和乳腺組織樣本。與低濃度（LC，30%精料）日糧相比，高濃度日糧增加了乳腺組織中STIM1和ORAI1的mRNA及蛋白質表達，并提高了乳腺組織中的Ca2?含量。升高的Ca2?激活了CaMKKβ-NF-κB通路，表現為p-IκB和p-p65的水平升高，促炎細胞因子（IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α）的表達增加，以及ORAI1與p65之間的相互作用增強。同時，高濃度日糧還激活了CaMKKβ-AMPK通路，進而上調了與自噬相關的蛋白質表達并誘導自噬。最終，高濃度日糧通過上調促凋亡蛋白（細胞色素C、Cleaved-Caspase3和BAX）的表達及下調抗凋亡蛋白（Bcl-2）促進了細胞凋亡。綜上所述，SARA通過上調STIM1/ORAI1表達，破壞了鈣離子平衡，進而通過CaMKKβ介導的NF-κB和AMPK-mTOR通路引發了Hu羊乳腺中的炎癥、自噬和細胞凋亡反應。
引言
高濃度日糧富含必需營養素，能有效滿足反芻動物的營養需求。短期內增加日糧中精料的比例通常能帶來積極效果，因此在繁殖期常被用于提高生產力和經濟效益。然而，雖然高濃度日糧能短期內提升反芻動物的生產性能，但長期或過量攝入可能導致瘤胃中乳酸和揮發性脂肪酸的積累，從而引發亞急性瘤胃酸中毒（SARA），給畜牧業造成重大經濟損失[1,2]。因此，在高密度飼養條件下實現生產性能與動物健康之間的平衡已成為亟待解決的關鍵問題。
鈣離子（Ca2?）在細胞內作為第二信使，參與多種生理過程。細胞內Ca2?水平的紊亂可能導致多種疾病。Store-operated calcium entry (SOCE) 通道是細胞外Ca2?進入細胞的主要途徑，主要由兩種關鍵蛋白組成：stromal interaction molecule 1 (STIM1) 和 calcium release-activated calcium modulator 1 (ORAI1)[3]。先前研究表明，β-胡蘿卜素可通過抑制STIM1和ORAI1來緩解LPS誘導的牛乳腺上皮細胞的內質網應激、線粒體損傷和細胞凋亡[4,5]。此外，白藜蘆醇能抑制SOCE通道的組成成分STIM1和ORAI1的表達，從而減少細胞外Ca2?的流入，抑制ERK1/2信號通路的激活并減輕HEK293細胞的損傷[6]。我們的前期研究發現，高濃度日糧會上調STIM1和ORAI1的表達，進而引發奶牛乳腺組織的炎癥反應和細胞凋亡[7]。進一步的體外實驗證實，LPS通過增強STIM1和ORAI1的表達，激活NF-κB信號通路，導致牛乳腺上皮細胞發生炎癥反應[8]。這些發現揭示了高濃度日糧通過調節鈣離子信號通路引發乳腺組織炎癥和細胞凋亡的潛在機制。
細胞內Ca2?濃度對于啟動自噬至關重要，其升高水平是這一過程的強大刺激因素。這一復雜過程通過CaMKKβ-AMPK通路進行調控，該通路又抑制mTOR信號通路，從而有效調節自噬[9, [10], [11]。在缺乏LKB1的細胞中，細胞內Ca2?水平的升高可通過CaMKKβ通路激活AMPK磷酸化[12]。Zheng等人的研究證實Orai1在促進自噬過程中起關鍵作用[13]，具體而言，沉默Orai1可顯著減少Angiotensin II誘導的LC3-II積累，并在體外和體內抑制心肌細胞的自噬[13]。因此，SOCE在維持細胞內Ca2?平衡中起著關鍵作用。然而，關于SARA條件下STIM1/ORAI1復合體介導的Ca2?流入及其通過CaMKKβ信號通路對機體的后續影響的研究仍較為有限。因此，有必要研究STIM1/ORAI1在Hu羊乳腺損傷中的調控機制，以尋找治療乳腺炎的新靶點。
因此，我們假設SARA會誘導STIM1和ORAI1的表達上調，進而破壞細胞內Ca2?平衡，從而觸發Hu羊乳腺組織中的炎癥、自噬和細胞凋亡反應。
倫理聲明
本動物實驗獲得了南京農業大學倫理委員會的批準，并遵循了該校的機構指南（協議編號NAJU.PZ2020102）。
實驗設計與樣本收集
選取12只平均體重為49.80 ± 5.00公斤的泌乳期Hu羊參與實驗，隨機分為兩組（每組6只），分別喂食低濃度（LC，30%精料）或高濃度（HC，70%精料）日糧。
高濃度日糧激活SOCE通道
先前研究證實，高濃度日糧會導致Hu羊乳腺組織中Ca2?含量升高并引發SARA。SOCE通道是細胞內Ca2?流動的主要途徑，因此本研究將重點探討高濃度日糧對乳腺組織中SOCE通道的影響，評估飲食改變對STIM1和ORAI1表達及功能的影響。
討論
亞急性瘤胃酸中毒（SARA）是反芻動物常見的代謝疾病，主要由瘤胃中揮發性脂肪酸的積累和瘤胃pH值下降引起。SARA不僅影響奶牛的健康，還會降低牛奶質量并造成經濟損失。研究表明，高濃度日糧會降低奶牛和山羊的瘤胃pH值，引發SARA并導致乳腺和肝臟損傷[20,7]。我們通過喂食高濃度日糧成功誘導了Hu羊的SARA。
結論
綜上所述，高濃度日糧通過上調STIM1和ORAI1的表達激活了SOCE通道，導致乳腺組織中Ca2?含量升高。升高的Ca2?水平通過上調CaMKKβ、NF-κB和AMPK-mTOR通路，引發炎癥和自噬，最終導致Hu羊乳腺組織的細胞凋亡（見圖8）。具體機制需進一步通過體外實驗進行驗證。
作者貢獻
孟美娟和常光軍負責實驗的設計與實施。孟美娟構思并撰寫了全文。任旭然、李學瑞和周善東負責實驗操作和數據分析。常光軍和沈向珍提供技術支持和材料保障。所有作者均審閱并批準了最終稿件。
資助
本研究得到了國家自然科學基金（32503121）、中國博士后科學基金會（GZC20240717）和寧夏回族自治區自然科學基金（2022AAC02072）的資助。
數據與材料的可獲取性
不適用
CRediT作者貢獻聲明
孟美娟：撰寫 – 審稿與編輯，撰寫 – 初稿，方法學設計，數據管理，概念構建。任旭然：方法學設計，數據管理。李學瑞：軟件應用，方法學設計。周善東：軟件應用，方法學設計。沈向珍：監督，方法學設計，實驗實施。常光軍：監督，方法學設計，資金爭取，數據分析。
利益沖突聲明
作者聲明不存在可能影響本文研究的已知財務利益或個人關系。
