乳腺癌是一種高度異質性的疾病，根據雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體-2（Her2）的表達狀態，可被劃分為不同的分子亞型，如管腔A型（LumA）、管腔B型（LumB）、Her2型和基底樣型。這些亞型在治療反應和患者預后上存在顯著差異，凸顯了在分子水平上進行分層的必要性�；�因表達受到稱為增強子的順式調控元件的精密控制，活躍的增強子會轉錄產生非編碼RNA，即增強子RNA（eRNA）。eRNA的表達是轉錄因子活性的早期指標，并與癌癥患者的治療反應和生存期相關。盡管已有泛癌癥研究鑒定出一些eRNA，但在高度異質的乳腺癌中，基于亞型對eRNA進行系統性分類及其功能關聯的研究仍不充分。本研究旨在利用機器學習方法，從大量乳腺癌患者的RNA-seq數據中，鑒定亞型特異性和預后相關的eRNA，并探索其調控網絡。

研究團隊從TCGA eRNA圖譜（TCeA）平臺下載了1095個乳腺癌患者樣本的eRNA表達數據集，這些數據基于Hnisz等人從H3K27ac染色質免疫沉淀測序（ChIP-seq）數據集中鑒定出的302,951個增強子位點。經過異常值過濾，最終975個腫瘤樣本的數據用于后續分析。為了識別亞型特異性eRNA，研究采用了兩種測量方法對eRNA表達的RPKM值進行處理：信息增益（InfoGain，基于k-means二值化）和對數均值中心化（Logmc，連續值）。隨后使用隨機森林（random forest）算法進行亞型分類，并評估分類效能。通過主成分分析（PCA）和UMAP進行降維可視化。此外，利用峰值集富集于基因集（PEGS）分析，將亞型特異性eRNA與同樣通過InfoGain方法鑒定的亞型特異性mRNA進行關聯，定義出鄰近共表達調控性eRNA（ProxCReAm，即與mRNA相關聯的鄰近共表達調控eRNA）及其配對關系。研究還整合了Cistrome平臺的轉錄因子ChIP-seq數據進行結合富集分析，利用TCGA-BRCA隊列的ATAC-seq數據進行基序富集分析，并通過KAS-seq（酮氧輔助單鏈DNA測序）在MCF7細胞中驗證增強子活性。生存分析采用Kaplan-Meier曲線和log-rank檢驗，并與已發表的Perturb-seq數據集進行整合，以驗證eRNA的功能相關性。

研究發現，基于InfoGain和Logmc兩種測量方法，機器學習模型都能有效鑒定出乳腺癌的亞型特異性eRNA。其中，InfoGain方法鑒定了更多eRNA，并且其分類性能指標（如對基底樣型的敏感性和對Her2型的精確度）略優于Logmc方法。PCA和UMAP可視化顯示，基于eRNA的表達譜能夠清晰區分基底樣型和管腔型患者，但無法進一步區分LumA和LumB亞型。Her2型患者的eRNA表達譜介于管腔型和基底樣型之間。有趣的是，無論采用哪種測量方法，均未能有效區分浸潤性導管癌和小葉癌的組織學亞型。熱圖和層次聚類分析進一步顯示，InfoGain方法鑒定的基底樣型高表達eRNA在基底樣型患者中高表達，在管腔型患者中低表達，反之亦然，形成了清晰的表達模式。相比之下，Logmc方法鑒定的eRNA表達模式更為混雜。因此，研究后續聚焦于InfoGain定義的eRNA進行深入分析。

研究同時鑒定了亞型特異性mRNA。與eRNA相比，mRNA在區分LumA和LumB亞型上表現稍好。通過PEGS分析，將亞型特異性eRNA與其1 Mb基因組距離內的亞型特異性mRNA進行關聯，定義了ProxCReAm eRNA-mRNA對。約81.45%的亞型特異性eRNA能以這種方式與mRNA關聯。特別值得注意的是，盡管單獨使用eRNA難以區分導管癌和小葉癌，但將低閾值下鑒定出的大量eRNA與mRNA關聯后得到的ProxCReAm eRNA，能夠更有效地區分這兩種組織學亞型。與這些小葉癌特異性ProxCReAm對相關的mRNA富集了與染色體16q缺失（包含腫瘤抑制因子CDH1）、腫瘤外周區上調基因（與侵襲性相關）等通路，提示增強子重編程可能驅動了小葉癌的侵襲性和耐藥性。

通路富集分析表明，ProxCReAm eRNA所關聯的mRNA顯著富集于各亞型的特征性通路。例如，基底樣型高表達eRNA關聯的通路包括基底樣特異性通路、Wnt/β-連環蛋白信號等；管腔A型eRNA關聯的通路則富含ER靶基因和管腔上調通路；Her2型eRNA關聯的通路涉及ERBB2擴增子相關基因。通過整合ATAC-seq、H3K27ac ChIP-seq、CAGE和GRO-seq等多組學數據，驗證了這些eRNA位點確實位于染色質開放、具有雙向轉錄活性的活躍增強子區域。有趣的是，盡管這些區域活躍，但雌激素受體（ER）的結合位點并不完全與eRNA位點中心重合，有時相距250-1000 bp。對Her2基因座附近eRNA的三維基因組（Hi-C）分析顯示，這些eRNA區域位于同一拓撲關聯域（TAD）內，可能通過染色質環化共同調控ERBB2等關鍵基因。

通過整合Cistrome的ChIP-seq數據，研究發現不同亞型的ProxCReAm eRNA位點顯著富集了不同的轉錄因子和表觀調控因子結合�；�底樣型高表達eRNA區域富集了TRIM28、H2AZ、EZH2、SPI1、MYB、CHD8等因子。管腔A型eRNA區域則顯著富集了糖皮質激素受體（GR）、芳香烴受體（AHR）、染色質重塑復合物亞基SMARCA4、CREBBP、HIF1A以及FOXA2/FOXO1等forkhead結構域蛋白，但ER本身并不顯著富集。Her2型eRNA區域富集了GR、HOXB7、ZNF384等因子。對eRNA側翼可及染色質區域（ATAC-seq峰）的轉錄因子結合基序分析進一步支持了上述發現：管腔型區域富集FOX和Ets相關因子基序；基底樣型區域富集RAR、AP1（Jun）、STAT、NF-κB等基序。為驗證管腔型eRNA的ER非依賴性，研究在MCF7細胞中進行了KAS-seq實驗，發現最強的單鏈DNA信號（代表活躍轉錄）和GRO-seq雙向轉錄信號區域，其ER結合信號反而較弱，這支持了活躍的增強子轉錄不一定與ER直接結合的觀點。

生存分析顯示，管腔A型特異性eRNA高表達的患者總生存期更好，這與ER陽性患者預后較好的已知現象一致。基底樣型和Her2型特異性eRNA的表達水平與患者總生存期無顯著關聯。然而，當專注于Her2亞型患者并根據其生存狀態（存活vs.死亡）重新進行機器學習分類時，InfoGain方法鑒定出了一組342個預后相關的Her2 eRNA。這組eRNA的高表達與Her2患者較差的預后顯著相關，其鄰近基因富集于細胞粘附/連接通路，暗示了上皮-間質轉化在不良預后中的作用。

通過整合已發表的Perturb-seq數據（在ER+和ER-乳腺癌細胞系中進行CRISPRi增強子擾動后的單細胞RNA-seq），研究驗證了部分鑒定出的eRNA的功能相關性。盡管重疊的增強子數量有限，但部分管腔A型和基底樣型特異性eRNA所在的擾動增強子，確實能影響下游基因表達。這些基因富集于IL-2/STAT5信號、雌激素反應、TNF-α信號等與各亞型生物學特性相關的通路。例如，一個與LumB相關的擾動增強子可影響EMID1基因的表達，該基因促進細胞增殖和轉移。

本研究強調了在異質性癌癥中，先進行分子分型再鑒定生物標志物的重要性。機器學習方法，特別是基于二值化表達的InfoGain測量，能有效鑒定出具有亞型特異性和預后價值的eRNA。通過構建ProxCReAm eRNA-mRNA對，研究不僅將增強子活性與下游基因功能聯系起來，還揭示了各亞型特有的上游轉錄調控網絡。一個關鍵發現是，在管腔型乳腺癌的活躍增強子中，除ER外，其他核受體（如GR、AHR）和FOX家族先鋒因子可能扮演更重要角色。此外，盡管傳統RNA-seq主要捕獲多聚腺苷酸化的轉錄本，但基于大量樣本分析的eRNA信號仍足以揭示高活性的調控框架。研究也指出了當前基于polyA捕獲的RNA-seq在探測不穩定eRNA方面的局限性，未來利用KAS-seq等新興技術直接檢測新生轉錄本將提供更全面的圖譜。對浸潤性小葉癌的分析表明，整合低表達閾值的eRNA與mRNA，能幫助解析其獨特的侵襲性相關網絡。最后，本研究鑒定的預后相關eRNA與先前泛癌癥研究發現的eRNA重疊很少，進一步說明了分型研究的必要性。

總而言之，本研究證明了在乳腺癌中，基于機器學習的eRNA表達譜分析能夠鑒定出具有亞型特異性、預后價值及功能相關性的增強子-基因調控網絡。這種方法為利用臨床上易獲取的RNA-seq數據，揭示腫瘤異質性背后的關鍵轉錄因子和表觀遺傳驅動因素，并開發潛在的預后生物標志物和治療靶點，提供了新的途徑。