《Materials Today Bio》：Liposomal Hydrogel-Based Oral Vaccine Delivery for Targeted Induction of Intestinal Mucosal Immunity
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為應(yīng)對(duì)口服疫苗面臨胃酸降解、腸黏膜駐留時(shí)間短等挑戰(zhàn)，南京工業(yè)大學(xué)團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種載有抗原和視黃酸的甘露糖修飾脂質(zhì)體/巰基化海藻酸凝膠微球復(fù)合遞送系統(tǒng)（MLip@Gel）。該平臺(tái)可在胃酸中保持穩(wěn)定，在腸道釋放抗原，并靶向遞送至腸道巨噬細(xì)胞，在小鼠和仔豬模型中有效誘導(dǎo)了高水平分泌型IgA和α4β7+CCR9+細(xì)胞活化，并激發(fā)系統(tǒng)性免疫應(yīng)答，為腸內(nèi)感染病的口服疫苗開發(fā)提供了有前景的策略。
病毒感染的威脅在全球范圍內(nèi)揮之不去，而疫苗接種依然是首選的預(yù)防盾牌。然而，傳統(tǒng)的注射型疫苗通常誘導(dǎo)血液中的IgG反應(yīng)，在身體的第一道防線——如腸道、呼吸道等黏膜表面，所激發(fā)的免疫激活往往有限。這無疑給那些以黏膜為入侵門戶的病原體留下了可乘之機(jī)。口服疫苗憑借其無創(chuàng)給藥和天然誘導(dǎo)黏膜免疫的潛力，被視為理想解決方案，但這條路布滿荊棘：抗原在抵達(dá)腸道免疫陣地前，需闖過胃部的強(qiáng)酸“熔爐”和無處不在的酶“剪刀”，即便僥幸抵達(dá)，也常因無法有效穿透腸黏膜、停留時(shí)間過短而被快速清除，難以被抗原提呈細(xì)胞（APCs）捕獲并啟動(dòng)強(qiáng)大的免疫應(yīng)答。如何為脆弱的抗原打造一款“隱形裝甲車”，既能護(hù)送其安全穿越消化道險(xiǎn)阻，又能精準(zhǔn)導(dǎo)航至腸道免疫要塞，并有效激活免疫系統(tǒng)，成為疫苗研發(fā)領(lǐng)域亟待攻克的關(guān)鍵難題。
針對(duì)上述挑戰(zhàn)，一項(xiàng)發(fā)表在《Materials Today Bio》上的研究給出了一份精巧的答卷。研究人員以極具破壞力的腸道冠狀病毒——豬流行性腹瀉病毒（PEDV）為模式抗原，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種新型口服疫苗遞送平臺(tái)。這個(gè)平臺(tái)的核心是一個(gè)多級(jí)復(fù)合系統(tǒng)：首先，他們將黏膜佐劑視黃酸（RA）和經(jīng)過甘露糖修飾的陽(yáng)離子脂質(zhì)體結(jié)合，形成PR-MLip；隨后，再用巰基化海藻酸（Cys-Alg）凝膠將脂質(zhì)體包裹起來，最終得到脂質(zhì)體凝膠微球（PR-MLip@Gel）。這套組合拳的設(shè)計(jì)理念明確：凝膠外殼作為“防彈衣”，抵御胃酸侵蝕；脂質(zhì)體作為“特洛伊木馬”，協(xié)助抗原穿透腸黏膜并促進(jìn)細(xì)胞攝取；其表面的甘露糖則像“精確制導(dǎo)”信號(hào)，引導(dǎo)載體靶向腸道巨噬細(xì)胞等APCs；而包裹在內(nèi)的RA則負(fù)責(zé)“煽風(fēng)點(diǎn)火”，促進(jìn)能分泌sIgA的漿細(xì)胞分化，從而強(qiáng)力激活黏膜免疫。
為了驗(yàn)證這一設(shè)計(jì)的可行性，研究團(tuán)隊(duì)綜合運(yùn)用了材料表征、體外模擬、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物模型等多種技術(shù)手段。在材料制備與表征方面，他們合成了巰基化海藻酸，并通過核磁氫譜、紅外光譜等技術(shù)確認(rèn)了修飾成功；利用薄膜水化法制備了載有RA的甘露糖修飾脂質(zhì)體，并通過動(dòng)態(tài)光散射、掃描電鏡、Zeta電位等分析了其粒徑、電位和形態(tài)；最后通過離子交聯(lián)法制備了凝膠微球，并通過掃描電鏡和熒光顯微鏡觀察了其微觀結(jié)構(gòu)及脂質(zhì)體的分布情況。在功能驗(yàn)證方面，他們通過模擬胃腸液降解與釋放實(shí)驗(yàn)，評(píng)估了系統(tǒng)的胃酸穩(wěn)定性和腸道響應(yīng)性釋放特性；利用離體豬腸段進(jìn)行了黏附實(shí)驗(yàn)，比較了不同凝膠的腸黏膜滯留能力；并采用熒光標(biāo)記的卵清蛋白（OVA）作為模型抗原，通過體外腸道滲透實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)（使用RAW264.7巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞）及小鼠活體成像，系統(tǒng)考察了遞送系統(tǒng)的滲透、靶向和分布行為。研究的核心部分是在小鼠和仔豬模型中進(jìn)行的免疫效果與保護(hù)力評(píng)價(jià)。小鼠實(shí)驗(yàn)設(shè)置了包括口服PR-MLip@Gel、口服游離PEDV、肌肉注射PEDV加鋁佐劑在內(nèi)的多個(gè)對(duì)照組，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了抗原提呈細(xì)胞的活化標(biāo)志物（CD80, CD86, MHC II）、腸道歸巢淋巴細(xì)胞（α4β7+CCR9+）以及脾臟T細(xì)胞（CD4+, CD8+）、B細(xì)胞、NK細(xì)胞的比例；通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)了血清、糞便和腸灌洗液中PEDV特異性的IgG、IgA抗體水平及中和抗體效價(jià)，并分析了脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子（IFN-γ, TNF-α, IL-4）。最終的攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)在7日齡PEDV陰性仔豬（來源未在樣本隊(duì)列部分特別注明，但實(shí)驗(yàn)遵守相關(guān)動(dòng)物倫理規(guī)范）中進(jìn)行，通過口服強(qiáng)毒株攻毒，評(píng)估了疫苗接種對(duì)臨床腹瀉癥狀、糞便病毒載量、腸道組織病理?yè)p傷及病毒抗原分布的保護(hù)效果。
研究結(jié)果層層遞進(jìn)，充分驗(yàn)證了PR-MLip@Gel系統(tǒng)的優(yōu)越性：
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成功制備了PR-MLip@Gel：材料表征證實(shí)成功合成了具有多孔結(jié)構(gòu)的凝膠微球，粒徑約200-250微米，內(nèi)部脂質(zhì)體分布均勻。載有RA的脂質(zhì)體粒徑約236納米，負(fù)載PEDV后增至約318納米，且穩(wěn)定性良好。
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PR-MLip@Gel具有胃酸抗性和腸道響應(yīng)性釋放能力：在模擬胃液（pH 1.2）中，凝膠微球能保持結(jié)構(gòu)完整6小時(shí)以上，藥物泄漏極少；一旦轉(zhuǎn)移至模擬腸液（pH 6.8），凝膠迅速溶脹崩解，從而在腸道定向釋放包裹的抗原和佐劑。
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脂質(zhì)體凝膠微球的腸道滯留能力增強(qiáng)：巰基化修飾顯著提高了凝膠在離體豬腸黏膜上的黏附率。小鼠活體成像顯示，F(xiàn)ITC-MLip@Gel在胃腸道內(nèi)的熒光信號(hào)更強(qiáng)、滯留時(shí)間更長(zhǎng)，直至給藥后24小時(shí)仍可檢測(cè)到。
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PR-MLip@Gel增強(qiáng)藥物吸收和靶向遞送：體外腸道滲透實(shí)驗(yàn)表明，F(xiàn)ITC-MLip@Gel的表現(xiàn)滲透系數(shù)最高。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，甘露糖修飾的脂質(zhì)體能被RAW264.7巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞更高效地?cái)z取，且該攝取可被游離的甘露糖競(jìng)爭(zhēng)性抑制，證明了其甘露糖受體介導(dǎo)的靶向性。
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PR-MLip@Gel增強(qiáng)抗原提呈和免疫激活：體外與小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表明，PR-MLip@Gel能最有效地促進(jìn)樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞高表達(dá)CD80、CD86和MHC II等成熟活化標(biāo)志物，并刺激它們分泌更高水平的IFN-γ、TNF-α和IL-4等細(xì)胞因子，顯示出強(qiáng)大的免疫佐劑活性。
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PR-MLip@Gel增強(qiáng)黏膜免疫和IgA產(chǎn)生：口服PR-MLip@Gel的小鼠，其腸道淋巴細(xì)胞中表達(dá)腸道歸巢受體α4β7和CCR9的比例最高，并且在血清、糞便及腸灌洗液中檢測(cè)到最高水平的PEDV特異性IgA抗體，顯著強(qiáng)于口服游離病毒組和肌肉免疫組，證明其能高效誘導(dǎo)黏膜免疫。
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口服疫苗誘導(dǎo)系統(tǒng)性免疫應(yīng)答：PR-MLip@Gel同樣激發(fā)了強(qiáng)烈的全身性免疫反應(yīng)，包括高水平的血清特異性IgG、卓越的中和抗體效價(jià)、顯著的脾淋巴細(xì)胞增殖、偏向Th1/Th2混合型的細(xì)胞因子譜，以及脾臟中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞比例的顯著增加。
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PR-MLip@Gel對(duì)免疫仔豬產(chǎn)生保護(hù)作用：攻毒實(shí)驗(yàn)是最終的“實(shí)戰(zhàn)檢驗(yàn)”。結(jié)果顯示，口服PR-MLip@Gel免疫的仔豬在遭受強(qiáng)毒攻擊后，幾乎不出現(xiàn)腹瀉，糞便中的病毒載量極低且短暫，腸道（空腸和回腸）組織病理?yè)p傷輕微，病毒抗原陽(yáng)性細(xì)胞稀少。其保護(hù)效果在降低腸道病毒載量和誘導(dǎo)腸道sIgA方面，甚至優(yōu)于傳統(tǒng)的肌肉注射加佐劑疫苗，彰顯了其誘導(dǎo)黏膜免疫在防御腸道感染中的關(guān)鍵作用。
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PR-MLip@Gel展示出良好的生物相容性：組織病理學(xué)分析顯示，接種PR-MLip@Gel的小鼠主要器官及腸道均未見明顯損傷，且小鼠體重增長(zhǎng)正常，表明該遞送系統(tǒng)具有良好的生物安全性。
綜上所述，這項(xiàng)研究成功構(gòu)建了一種集“胃酸保護(hù)、腸道黏附、黏膜穿透、細(xì)胞靶向、免疫佐劑”于一體的智能口服疫苗遞送系統(tǒng)。其創(chuàng)新之處在于將甘露糖靶向的陽(yáng)離子脂質(zhì)體與巰基化海藻酸凝膠進(jìn)行有機(jī)整合，協(xié)同解決了口服疫苗遞送中的多重屏障。該平臺(tái)不僅能在胃部極端環(huán)境中保護(hù)抗原，還能在腸道精準(zhǔn)定位并長(zhǎng)效釋放，通過靶向抗原提呈細(xì)胞和利用視黃酸的佐劑效應(yīng)，同時(shí)激發(fā)出強(qiáng)大的黏膜免疫（以高水平的sIgA和歸巢淋巴細(xì)胞為特征）和系統(tǒng)免疫應(yīng)答。最終在仔豬攻毒模型中所展現(xiàn)出的卓越保護(hù)效果，強(qiáng)有力地證明了這種策略的有效性。這項(xiàng)研究不僅為開發(fā)抗PEDV等腸道傳染病的口服疫苗提供了切實(shí)可行的新方案，其模塊化、多功能的遞送平臺(tái)設(shè)計(jì)思路，也為更廣泛的口服生物制劑（如其他疫苗、蛋白質(zhì)藥物、核酸藥物）的研發(fā)開辟了新的路徑，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的轉(zhuǎn)化應(yīng)用前景。
