在人類呼吸健康領域，如何準確、早期地評估化學物質的肺部毒性一直是個巨大的挑戰。從日常使用的消毒劑、防腐劑，到工業生產中釋放的化學物質，持續不斷地通過空氣、水和各種產品進入人體，與一系列嚴重的肺部疾病相關，如上皮損傷、纖維化和慢性呼吸功能障礙。然而，傳統的毒性評估方法存在明顯局限。它們通常依賴于二維培養的永生化細胞系，這些細胞缺乏人體肺組織復雜的細胞多樣性和三維結構，難以真實模擬生理環境。更重要的是，常規方法主要測量細胞凋亡、活性氧生成或活力喪失等晚期結局，這些指標往往反映的是不可逆的細胞損傷，而無法捕捉到那些在細胞明顯死亡前發生的、短暫且可逆的早期應激反應。這就好比是等房子塌了才去檢查結構問題，為時已晚。為了填補這一空白，科學界急需一種能夠模擬人類肺部生理、并能實時監測早期應激信號的先進體外模型。

正是在這樣的背景下，一項發表于《Materials Today Bio》的研究帶來了突破。該研究旨在開發一種新型的、更具預測性的肺毒性評估平臺。為了實現這個目標，研究人員巧妙地融合了前沿的生物技術。他們利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術，將一個熒光蛋白mCherry的標簽精準地插入到人誘導多能干細胞（human induced pluripotent stem cell, hiPSC）的內源性G3BP1基因位點，從而構建了一個內源性表達G3BP1–mCherry融合蛋白的hiPSC系。G3BP1是應激顆粒（Stress Granule, SG）——一種在細胞遭遇壓力時形成的臨時性核糖核蛋白凝聚體——的關鍵成核蛋白。通過這種基因打靶策略，熒光信號能隨著內源性G3BP1的表達而自然呈現，避免了過表達帶來的假象。隨后，研究人員將這種工程化的干細胞一步步誘導分化為三維的、具有復雜細胞組成的人肺類器官（human lung organoids, hLOs）。最終，他們將這個能實時“發光”報告應激狀態的干細胞系，與能模擬人體肺部復雜結構的類器官技術相結合，創造出了一個革命性的平臺。這個平臺的核心在于，能夠在不破壞樣本的情況下，通過熒光顯微鏡活體、實時地觀察當肺類器官暴露于有毒化學物質時，細胞內部應激顆粒（SG）是如何快速形成、變化甚至消失的。這為在細胞受到不可逆傷害之前，就捕捉到最早期的“求救信號”提供了可能。該研究還整合了高內涵篩選（high-content screening, HCS）技術，實現了對大量細胞樣本中SG動態的自動化、定量化分析，極大地提升了通量和可重復性。這不僅僅是觀察工具的升級，更是一種毒性評估范式的轉變，為邁向基于人類生理相關模型的新方法（New Approach Methodology, NAM）鋪平了道路。

在技術方法層面，作者主要運用了以下幾項關鍵技術：1) CRISPR/Cas9介導的內源性基因敲入：構建了穩定表達G3BP1–mCherry融合蛋白的hiPSC系。2) 人誘導多能干細胞向肺類器官的分化與成熟：通過多階段的細胞因子誘導，將hiPSC分化為包含氣道和肺泡上皮細胞類型的3D肺類器官，并優化了懸浮培養和表觀遺傳調節劑（5-aza-dC）的使用以促進成熟。3) 高內涵活細胞成像：利用自動化成像系統對暴露于不同毒物的類器官進行長時間、多時間點的熒光成像，定量分析SG的形成與動力學。4) 單細胞RNA測序：對分化后的類器官進行單細胞轉錄組分析，以全面解析其細胞組成和譜系特征。研究中使用的hiPSC系（CMC-hiPSC-009）來自韓國國家干細胞庫，患者來源的肺癌類器官（LCO）系SNU-2689-CO則來自韓國細胞系庫。

研究人員首先利用CRISPR/Cas9技術，成功將mCherry熒光蛋白標簽精準融合到hiPSC內源性G3BP1基因的C末端。通過基因分型PCR、Sanger測序和蛋白質印跡分析，證實了敲入的正確性以及G3BP1–mCherry融合蛋白的表達。更重要的是，當細胞暴露于經典的SG誘導劑亞砷酸鈉時，原本彌散的mCherry熒光迅速凝聚成明顯的點狀結構，證實了該報告系統能有效、實時地可視化應激顆粒的形成。此外，該敲入細胞系保持了正常的核型、多能性標志物的表達以及向三個胚層分化的能力，證明基因編輯沒有損害干細胞的基本特性。這為后續構建功能性的肺類器官報告系統奠定了堅實基礎。

研究人員成功地將工程化的hiPSC逐步分化為肺類器官。為了獲得更成熟、更接近生理狀態的肺上皮，他們比較了兩種成熟培養基：DCIF10（含地塞米松、cAMP、IBMX和FGF10）和在DCIF10基礎上添加了DNA去甲基化劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷（5-aza-dC）的DCIF10A。研究發現，在懸浮培養條件下，使用DCIF10A培養基能更有效地促進類器官的成熟。透射電鏡觀察到了類器官細胞內存在板層小體樣結構，這是肺泡II型上皮細胞的典型特征。基因和蛋白水平分析也證實，成熟的類器官中同時表達了氣道基底細胞、杯狀細胞、克拉拉細胞、纖毛細胞以及肺泡I型和II型上皮細胞的標志物。這表明優化后的培養體系成功誘導出了具有高度細胞多樣性的肺上皮組織。

為了精確解析類器官的細胞組成，研究人員進行了單細胞RNA測序分析。結果在肺類器官的上皮細胞中鑒定出了7個不同的細胞群體：基底細胞、KRT5^-/KRT17⁺過渡細胞、分泌細胞、杯狀細胞、肺泡樣上皮細胞、增殖細胞和神經內分泌細胞。其中分泌細胞占比最高。標志基因表達譜支持了這些細胞類型的注釋。進一步的發育成熟度基準分析顯示，該類器官的轉錄組特征與胎兒肺組織更為接近，表明其處于一個器官樣但發育上相對未成熟的狀態。這一定量分析從轉錄組層面證實了該肺類器官模型成功重建了人類肺上皮的細胞復雜性。

研究最核心的部分是驗證該平臺實時監測SG動態的能力。活細胞成像顯示，當肺類器官暴露于亞砷酸鈉時，細胞質中的G3BP1–mCherry信號在10-20分鐘內就從彌散狀態快速凝聚成離散的點狀SG，并在約30分鐘達到峰值，隨后開始減少，展現了SG形成的快速性和可逆性。這種響應具有劑量和時間依賴性。不僅如此，對于作用機制不同的其他毒物，如膜活性殺菌劑苯扎氯銨（BAC）和親電性防腐劑苯并異噻唑啉酮（BIT），該報告系統同樣能檢測到SG的形成。這證明G3BP1–mCherry肺類器官平臺能夠廣譜、敏感地檢測由不同化學物質引發的早期細胞應激。

為了評估新模型的預測價值，研究人員比較了工程化肺類器官、A549肺癌細胞（2D和3D球體）以及患者來源的肺癌類器官對不同毒物的敏感性。細胞活力測定結果顯示，對于測試的所有代表性毒物（如DDAC、OIT、PHMG-p、4,4’-MDI和丙烯腈），hiPSC來源的肺類器官的IC₅₀值均顯著低于A549細胞，表明其對化學誘導的細胞毒性更為敏感。在包括A549球體、肺癌類器官和肺類器官的3D模型橫向比較中，肺類器官對亞砷酸鈉、BAC和BIT也 consistently表現出最高的敏感性（最低的IC₅₀）。進一步的免疫熒光分析發現，在亞砷酸鈉暴露下，肺類器官中SG形成的劑量閾值低于腫瘤來源的肺癌類器官。這些結果共同表明，源自正常干細胞的肺類器官比永生化或癌變的細胞模型能更早、更敏感地捕捉到化學應激信號，更能代表正常人體肺組織對毒物的反應。

最后，研究探討了SG這一早期信號與更終端的組織功能損傷——上皮屏障完整性之間的關系。活細胞成像顯示，SG在毒物暴露期間迅速組裝，在毒物移除后逐漸解離。免疫熒光分析緊密連接蛋白ZO-1發現，短期暴露（1小時）后給予恢復期，上皮屏障結構基本得以保持；而持續高劑量暴露（3小時）則會導致ZO-1連接組織的明顯破壞。重要的是，在兩種暴露條件下，SG都在早期被強烈誘導，但只有持續暴露導致了明顯的屏障損傷。這表明SG的形成是一個先于明顯上皮損傷的早期事件。這一發現將分子水平的早期應激適應與組織層面的功能響應聯系了起來，支持將SG成像作為預測潛在組織損傷的早期、靈敏的生物標志物。

在結論和討論部分，該研究強調，所構建的G3BP1–mCherry hiPSC肺類器官平臺成功地將內源性SG報告基因、人類生理相關的3D肺組織模型以及高內涵活細胞成像技術融為一體。這一平臺的核心意義在于它能夠實時、無損地可視化并定量分析化學毒物暴露下最早的細胞應激反應之一——應激顆粒的動力學。這克服了傳統毒性檢測方法只能捕獲晚期、不可逆損傷事件的局限。該肺類器官模型重現了人類肺上皮的細胞多樣性和組織結構，其對毒物的敏感性高于永生化或腫瘤細胞模型，預測價值更高。研究還揭示了SG動態與暴露時間依賴性的上皮功能損傷之間的關聯，為區分可逆的適應性應激和可能導致組織損傷的有害暴露提供了新的視角。綜上所述，這項工作不僅為肺部毒性評估提供了一種強大、敏感且具有預測性的新方法（NAM），其內源報告基因策略和hiPSC的可分化多能性，也為將該平臺擴展至其他器官的毒性評估和更廣泛的化學安全評價奠定了基礎。