《Materials Today Bio》：Carrier-Free Supramolecular Architectonics of Quercetin
–Berberine for Safety-Redefined Therapy of Ulcerative Colitis
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本文針對潰瘍性結(jié)腸炎（UC）現(xiàn)有療法療效有限、副作用顯著的問題，介紹了一項利用天然小分子槲皮素（QU）與小檗堿（BBR）構(gòu)建無載體自組裝納米結(jié)構(gòu)（QB）的創(chuàng)新研究。該研究闡明了其自組裝機制，證實QB可顯著拓寬BBR的安全窗口，在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中展現(xiàn)出優(yōu)異的抗炎、抗氧化、修復(fù)腸黏膜屏障及調(diào)節(jié)腸道菌群的多重功效。這項研究為開發(fā)高效、安全的天然藥物納米遞送平臺提供了新策略。
潰瘍性結(jié)腸炎是一種慢性、易復(fù)發(fā)的炎癥性腸病，給全球公共衛(wèi)生帶來沉重負擔(dān)。目前的臨床管理主要依賴于5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑和生物制劑等，但這些方案常常面臨緩解率有限、長期給藥副作用明顯以及治療成本高昂等問題。相當(dāng)一部分患者最終仍需要進行結(jié)腸切除術(shù)，這凸顯出現(xiàn)有藥物治療在安全性和有效性之間難以達到最佳平衡。因此，開發(fā)兼具高安全性、強效力和良好患者依從性的口服治療策略，成為該領(lǐng)域的迫切需求。
在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病過程中，持續(xù)的免疫激活、氧化還原穩(wěn)態(tài)破壞和腸道上皮屏障損傷緊密交織，共同驅(qū)動疾病進展。過量的活性氧會誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化和DNA損傷，放大炎癥級聯(lián)反應(yīng)；而緊密連接蛋白和黏液層的損傷則會破壞屏障完整性，使得管腔內(nèi)抗原穿透黏膜，維持免疫細胞浸潤。近期的研究表明，針對單一炎癥介質(zhì)或單一抗氧化靶點的干預(yù)不足以維持長期緩解；相反，更有效的策略是整合抗炎、抗氧化和黏膜修復(fù)效應(yīng)，通過全面的微環(huán)境調(diào)控來恢復(fù)黏膜穩(wěn)態(tài)。具有多靶點藥理學(xué)特征和良好安全性特征的天然小分子，被認為是實現(xiàn)這一目標的有力候選者。
槲皮素（QU）和小檗堿（BBR）是兩種具有代表性的天然小分子藥物，具有明確的抗炎、抗氧化和保護黏膜的活性。然而，它們自身在開發(fā)成藥性方面存在顯著障礙。QU水溶性極低，口服給藥困難；而BBR作為一種季銨鹽生物堿，其有效的抗炎活性劑量非常接近誘導(dǎo)細胞毒性的劑量，導(dǎo)致其治療指數(shù)低、安全窗口窄。此外，QU和BBR分別代表陰離子多酚和陽離子生物堿，如何在不依賴表面活性劑或聚合物載體的條件下，僅通過分子間非共價相互作用，設(shè)計出統(tǒng)一、穩(wěn)定且可控的納米實體，同時減輕它們固有的缺陷，仍然是無載體納米藥物開發(fā)中尚未滿足的核心需求。
在此背景下，河北醫(yī)科大學(xué)的研究人員開發(fā)了一種基于QU和BBR的無載體超分子自組裝策略，構(gòu)建了全天然共組裝納米結(jié)構(gòu)（QB），并深入探究了其在潰瘍性結(jié)腸炎治療中的應(yīng)用。該研究成果發(fā)表在《Materials Today Bio》期刊上。
為了開展這項研究，研究人員運用了多項關(guān)鍵技術(shù)。他們通過簡單的納米沉淀法制備了QB，并利用場發(fā)射掃描電子顯微鏡、動態(tài)光散射等技術(shù)對其形貌、粒徑和穩(wěn)定性進行了表征。通過紫外-可見光譜、熒光光譜、傅里葉變換紅外光譜、X射線衍射、熱重分析、高分辨率質(zhì)譜、核磁共振氫譜以及全原子分子動力學(xué)模擬等一系列技術(shù)，系統(tǒng)闡明了QU與BBR之間的自組裝機制。在細胞水平，使用脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7巨噬細胞炎癥模型評估了QB的細胞相容性及抗炎、抗氧化活性。在動物水平，建立了葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型，系統(tǒng)評價了QB的治療效果，并與單一藥物及陽性藥5-ASA進行了比較。此外，研究還結(jié)合了結(jié)腸組織轉(zhuǎn)錄組測序和腸道菌群16S rRNA測序，從多維度解析了QB對腸道炎癥、氧化應(yīng)激、黏膜修復(fù)和微生物穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)作用。
研究結(jié)果部分如下：
2.1. QB的制備與形貌表征
研究人員通過簡單的納米沉淀法制備了QB。掃描電鏡顯示其呈均勻的球形顆粒，直徑約為200-240 nm。動態(tài)光散射測得其平均流體動力學(xué)直徑約為230 nm，多分散指數(shù)低，且具有約-42 mV的強負Zeta電位，表明其分散性良好且在溶液中表現(xiàn)為陰離子實體。QB在水和磷酸鹽緩沖液中14天內(nèi)粒徑穩(wěn)定，顯示了優(yōu)異的膠體穩(wěn)定性。分子動力學(xué)模擬顯示，QU和BBR分子能在水溶液中快速形成穩(wěn)定的納米聚集體。
2.2. QB的自組裝機制
通過光譜學(xué)、X射線衍射、熱重分析和分子動力學(xué)模擬的綜合分析，研究人員闡明了QB的自組裝機制。結(jié)果表明，QU和BBR通過多位點氫鍵和π-π堆積相互作用驅(qū)動自組裝，形成摩爾比為1:1的穩(wěn)定超分子結(jié)構(gòu)。X射線衍射顯示QB為無定形結(jié)構(gòu)，熱重分析進一步證實了其獨特的無定形共組裝特征。競爭性擾動實驗和核磁共振分析直接揭示了氫鍵網(wǎng)絡(luò)和芳香堆積相互作用是維持QB穩(wěn)定性的關(guān)鍵。分子動力學(xué)模擬的能量分解表明，范德華相互作用（與π-π堆積相關(guān)）是組裝過程的主導(dǎo)力量。
2.3. QB在結(jié)腸和脾臟的富集
通過負載近紅外染料IR780構(gòu)建QB@IR780復(fù)合物進行體內(nèi)示蹤，發(fā)現(xiàn)QB在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的炎癥結(jié)腸部位具有顯著的選擇性富集和長時間滯留，而在健康小鼠結(jié)腸中蓄積很少。此外，QB在脾臟也有明顯富集，并伴隨脾臟組織中促炎細胞因子水平的降低和抗炎因子IL-10的增加，表明其參與了系統(tǒng)性免疫穩(wěn)態(tài)的重塑。
2.4. QB的體外細胞相容性及納米增強的抗炎活性
細胞實驗表明，與游離的QU和BBR相比，QB顯著拓寬了安全劑量范圍，特別是在RAW264.7巨噬細胞中，QB在高達80 μM的濃度下仍保持幾乎100%的細胞活力，而同等劑量的游離BBR則顯示出明顯細胞毒性。在LPS刺激的巨噬細胞炎癥模型中，QB在非毒性濃度下能劑量依賴性地抑制一氧化氮（NO）以及腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β、白細胞介素-6等促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，并恢復(fù)谷胱甘肽過氧化物酶水平，顯示出協(xié)調(diào)的抗炎和抗氧化活性。
2.5. QB在DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型中的治療效果
在動物模型中，QB治療能顯著減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠體重下降、疾病活動指數(shù)評分和結(jié)腸縮短，效果優(yōu)于5-ASA及QU、BBR單藥治療。組織病理學(xué)分析顯示，QB能有效緩解黏膜糜爛、保護隱窩結(jié)構(gòu)、減輕上皮屏障損傷和炎癥細胞浸潤。阿爾新藍-過碘酸雪夫染色顯示QB能促進杯狀細胞和黏液分泌的恢復(fù)。
2.6. QB減輕結(jié)腸炎小鼠的氧化應(yīng)激
二氫乙啶熒光染色顯示，QB治療能顯著降低結(jié)腸組織中的活性氧水平。酶聯(lián)免疫吸附測定結(jié)果進一步證實，QB能恢復(fù)超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等關(guān)鍵抗氧化酶的蛋白水平，同時降低促氧化酶黃嘌呤氧化酶的水平，表明其在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和重建氧化還原穩(wěn)態(tài)方面具有突出作用。
2.7. QB增強上皮屏障完整性并促進結(jié)腸黏膜修復(fù)
免疫組化染色顯示，QB能有效恢復(fù)緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達。體內(nèi)異硫氰酸熒光素-葡聚糖滲透性實驗證實，QB能顯著降低腸道通透性，恢復(fù)上皮屏障功能。同時，基于5-溴-2’-脫氧尿苷摻入的免疫熒光分析表明，QB能顯著增強結(jié)腸組織的細胞增殖活性，并促進β-連環(huán)蛋白在隱窩基部的定位，表明其激活了黏膜再生通路。
2.8. 轉(zhuǎn)錄組分析揭示QB納米顆粒在結(jié)腸炎中的多維調(diào)節(jié)作用
對結(jié)腸組織進行RNA測序分析發(fā)現(xiàn)，QB治療能部分糾正DSS引起的轉(zhuǎn)錄組紊亂，使其表達譜向健康狀態(tài)回調(diào)。差異表達基因和通路富集分析表明，QB能協(xié)同下調(diào)免疫炎癥相關(guān)通路（如NF-κB信號通路），同時上調(diào)與抗氧化解毒、細胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)和黏膜再生相關(guān)的通路�；蚣患治鲞M一步證實，QB顯著負向調(diào)節(jié)炎癥性腸病和NF-κB信號通路，而正向調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路。
2.9. QB干預(yù)調(diào)節(jié)腸道微生物組的功能網(wǎng)絡(luò)
腸道菌群16S rRNA測序分析顯示，DSS處理導(dǎo)致微生物多樣性顯著降低，菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生劇變，表現(xiàn)為有益菌門（如厚壁菌門、放線菌門）減少，而潛在致病菌門（如變形菌門、脫鐵桿菌門）異常擴增。QB治療能有效恢復(fù)微生物多樣性，逆轉(zhuǎn)這種菌群失調(diào)，增加有益菌的相對豐度，抑制與炎癥和黏膜損傷相關(guān)菌群的擴增。菌群-表型相關(guān)性分析支持了QB誘導(dǎo)的菌群重塑與炎癥減輕、氧化應(yīng)激狀態(tài)改善和上皮屏障完整性恢復(fù)之間的關(guān)聯(lián)。
2.10. QB表現(xiàn)出優(yōu)異的生物相容性
主要器官的組織學(xué)檢查顯示，QB治療后小鼠的肺、心、肝、脾、腎結(jié)構(gòu)完整，未觀察到病理改變或炎癥浸潤，結(jié)合細胞水平的活力實驗結(jié)果，表明QB具有良好的生物安全性。
研究結(jié)論與討論：
本研究成功構(gòu)建了一種無載體超分子QB系統(tǒng)，實現(xiàn)了從傳統(tǒng)的“藥物+載體”范式向“藥物即材料”策略的實質(zhì)性轉(zhuǎn)變。通過納米尺度的共組裝，QB克服了BBR安全窗口窄的典型成藥性障礙，在此基礎(chǔ)上利用協(xié)同的非共價相互作用形成了穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)，并實現(xiàn)了在炎癥結(jié)腸的高效富集，從而能夠?qū)ρ装Y抑制、氧化還原穩(wěn)態(tài)恢復(fù)、黏膜再生和腸道菌群重塑進行整合的多靶點干預(yù)。
在機制上，本研究的多組學(xué)和表型結(jié)果共同指向一個耦合的疾病框架，其中炎癥放大、氧化還原失衡和屏障破壞相互加強，共同維持結(jié)腸炎的進展。QB以一種協(xié)調(diào)的方式中斷了這個自我放大的循環(huán)：轉(zhuǎn)錄組特征表明，QB廣泛減弱了免疫炎癥程序，同時增強了抗氧化/解毒過程，再生相關(guān)程序也同步得到增強，這與體內(nèi)觀察到的氧化負荷減輕、炎癥表型緩解以及屏障結(jié)構(gòu)/功能改善相一致。這種協(xié)調(diào)的“減壓-修復(fù)”模式為QB的綜合治療效果提供了機制基礎(chǔ)，并支持了其超越療效增強的安全重構(gòu)理念。
與以往多數(shù)側(cè)重于提高溶解度、增強靶向性或協(xié)同療效的無載體系統(tǒng)不同，本研究將“安全窗口擴展”作為一個關(guān)鍵指標，并提供了定量證據(jù)。QB在細胞實驗中相對于游離BBR顯著拓寬了耐受濃度范圍（約16倍），且體內(nèi)治療后主要器官組織學(xué)未見明顯病理改變。這些以安全為中心的驗證，使QB區(qū)別于以療效為導(dǎo)向的無載體系統(tǒng)，支持了一種以安全重構(gòu)為核心的無載體協(xié)同組裝策略。
更重要的是，QB闡明了一個可推廣的設(shè)計原則：協(xié)同自組裝可用于共同優(yōu)化天然小分子的成藥性限制，特別是溶解性/穩(wěn)定性限制和狹窄的安全窗口。通過選擇結(jié)構(gòu)互補、功能協(xié)同的配對分子，并利用協(xié)同的非共價相互作用，可以構(gòu)建“藥物即載體”的納米實體，從而實現(xiàn)多通路干預(yù)并降低安全負擔(dān)。鑒于許多慢性炎癥性疾病都具有免疫失調(diào)、氧化應(yīng)激和屏障損傷的耦合特征，該框架為將無載體天然藥物組裝體擴展到更多炎癥適應(yīng)癥提供了一條實用途徑。
綜上所述，QB例證了一種基于天然小分子的無載體自組裝策略，該策略在簡化制造工藝的同時，為重新設(shè)計天然藥物的安全性特征和治療窗口提供了一個通用藍圖，并為潰瘍性結(jié)腸炎及其他慢性炎癥性疾病的下一代納米治療平臺奠定了基礎(chǔ)。
