膿毒癥是機(jī)體對(duì)感染的異常反應(yīng)，常導(dǎo)致危及生命的多器官功能障礙，其中肺部是最常受累的器官之一。膿毒癥誘發(fā)的急性肺損傷(ALI)以失控的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、血管通透性增加和大量免疫細(xì)胞浸潤(rùn)為特征，臨床管理手段有限，急需新的治療方法。在復(fù)雜的肺部微環(huán)境中，駐留的肺泡上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞不僅是炎癥的被動(dòng)受害者，更是驅(qū)動(dòng)炎癥風(fēng)暴的活躍參與者。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(Poly (ADP-ribose) polymerase-1, PARP-1)是DNA修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞死亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其在膿毒癥中的過(guò)度活化是ALI病理過(guò)程的重要介質(zhì)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞能量耗竭和一種名為parthanatos的程序性細(xì)胞死亡，從而加劇炎癥和組織損傷。然而，傳統(tǒng)PARP-1抑制劑的全身性應(yīng)用存在脫靶效應(yīng)和難以精準(zhǔn)遞送至靶細(xì)胞等問(wèn)題。近年來(lái)，生物仿生藥物遞送系統(tǒng)，特別是利用內(nèi)源性靶向配體的策略，為提高組織特異性和細(xì)胞選擇性帶來(lái)了希望。肺表面活性蛋白A(Surfactant protein A, SPA)是肺部固有免疫防御的關(guān)鍵蛋白，能與肺泡上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的受體相互作用，是理想的肺靶向配體。本研究發(fā)表于《Materials Today Bio》，旨在開發(fā)一種精準(zhǔn)靶向致病細(xì)胞、有效抑制PARP-1的膿毒癥肺損傷治療新策略。

為開展研究，作者運(yùn)用了單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)分析膿毒癥肺部免疫微環(huán)境，并構(gòu)建了SPA穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系以制備功能化微粒。關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)技術(shù)包括：通過(guò)電穿孔技術(shù)將奧拉帕尼(OLA)載入SPA修飾的微粒(MPs)構(gòu)建靶向遞送系統(tǒng)(OLA@SPA MPs)；利用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠模型和盲腸結(jié)扎穿孔(CLP)模型模擬膿毒癥肺損傷；采用體內(nèi)外成像、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光、蛋白質(zhì)印跡(Western blot)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等技術(shù)，系統(tǒng)評(píng)估了該遞送系統(tǒng)的靶向性、療效、安全性和作用機(jī)制。

研究結(jié)果如下：

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析鑒定肺上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是膿毒癥肺部的主要促炎樞紐：通過(guò)對(duì)公開數(shù)據(jù)集(GSE207651)的分析，發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠肺部上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的促炎細(xì)胞因子基因表達(dá)顯著上調(diào)，且Parp1基因表達(dá)升高。KEGG通路富集分析顯示，這些細(xì)胞的差異表達(dá)基因富集在NF-κB、TNF、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用及NOD樣受體信號(hào)等炎癥相關(guān)通路。細(xì)胞間通訊分析進(jìn)一步證實(shí)，在膿毒癥狀態(tài)下，肺上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞與其他細(xì)胞間的通訊顯著增強(qiáng)。這些發(fā)現(xiàn)為細(xì)胞靶向治療提供了理論基礎(chǔ)。

建立膿毒癥誘導(dǎo)的肺損傷模型并構(gòu)建用于靶向遞送奧拉帕尼的SPA功能化微粒：成功建立了LPS誘導(dǎo)的小鼠肺損傷模型，并證實(shí)模型中存在PARP-1通路過(guò)度活化。研究人員構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)SPA的小鼠肺上皮MLE-12細(xì)胞系，并從中分離出SPA功能化的微粒(SPA MPs)，再通過(guò)優(yōu)化電穿孔參數(shù)，將PARP-1抑制劑奧拉帕尼(OLA)高效載入，形成OLA@SPA MPs。該微粒具有典型的囊泡形態(tài)和生物標(biāo)志物表達(dá)，SPA修飾和藥物裝載顯著增強(qiáng)了其被靶細(xì)胞的攝取效率，并在血清中表現(xiàn)良好穩(wěn)定性。

體外評(píng)估OLA@SPA-MPs對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞損傷的保護(hù)作用：體外實(shí)驗(yàn)表明，OLA@SPA MPs能顯著恢復(fù)LPS損傷的MLE-12和MH-S細(xì)胞活力，效果優(yōu)于游離OLA或非靶向的OLA@MPs。機(jī)制上，SPA修飾通過(guò)CKAP4受體介導(dǎo)顯著增強(qiáng)了微粒在靶細(xì)胞內(nèi)的攝取。OLA@SPA MPs能有效抑制LPS誘導(dǎo)的PARP-1活化及其產(chǎn)物聚腺苷二磷酸核糖(PAR)的積累，減少凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)的核轉(zhuǎn)位，從而抑制parthanatos細(xì)胞死亡途徑，保護(hù)細(xì)胞。

OLA@SPA MPs在膿毒癥小鼠體內(nèi)表現(xiàn)出卓越的肺靶向效率和強(qiáng)大的保護(hù)作用：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)靜脈注射后，OLA@SPA MPs在肺部表現(xiàn)出比非靶向微粒更強(qiáng)、更持久的富集，并能特異性被CD326⁺肺上皮細(xì)胞和F4/80⁺巨噬細(xì)胞內(nèi)化。在致死性膿毒癥模型中，OLA@SPA MPs治療顯著提高了小鼠的生存率，改善了臨床評(píng)分，并有效減輕了肺組織的病理?yè)p傷、水腫和血管滲漏。

闡明OLA@SPA MPs治療膿毒癥小鼠模型的機(jī)制：治療顯著降低了血清和支氣管肺泡灌洗液(BALF)中促炎因子(IL-6, TNF-α, IL-1β)的水平，同時(shí)升高了抗炎因子IL-10。免疫熒光證實(shí)，OLA@SPA MPs能有效抑制肺內(nèi)靶細(xì)胞中PARP-1的過(guò)度活化。轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)一步揭示，OLA@SPA MPs處理逆轉(zhuǎn)了膿毒癥相關(guān)的基因表達(dá)譜，顯著下調(diào)了NOD樣受體、TNF和NF-κB等關(guān)鍵促炎信號(hào)通路。

體外和體內(nèi)生物相容性評(píng)估：安全性評(píng)估表明，將OLA封裝于SPA MPs中降低了其細(xì)胞毒性。在健康小鼠中單次靜脈注射治療劑量的OLA@SPA MPs，未引起主要器官的明顯病理?yè)p傷、體重下降或血液學(xué)、生化指標(biāo)異常，顯示出良好的生物相容性。

本研究通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序精準(zhǔn)定位了膿毒癥肺損傷的關(guān)鍵細(xì)胞靶點(diǎn)，并成功構(gòu)建了一種基于SPA的仿生靶向遞送系統(tǒng)。OLA@SPA MPs能高效靶向肺上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)PARP-1的精準(zhǔn)抑制，從而有效緩解細(xì)胞因子風(fēng)暴、保護(hù)肺組織、提高生存率。這項(xiàng)工作不僅為膿毒癥誘發(fā)的急性肺損傷提供了一種極具前景的新型治療策略，其SPA引導(dǎo)的靶向平臺(tái)也為其他涉及上皮-巨噬細(xì)胞功能障礙的炎癥性肺病（如急性呼吸窘迫綜合征、重癥肺炎）的治療提供了新思路。