《Materials Today Bio》：Umbilical cord mesenchymal stem cells and their extracellular vesicles attenuate cryopreservation-induced ovarian injury via the suppression of ferroptosis in an in vitro culture system
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為解決卵巢組織冷凍保存移植后損傷大、療效受限的問題，該研究探討了臍帶間充質干細胞及其外泌體通過調控鐵死亡修復卵巢冷凍損傷的作用。研究發現，鐵死亡是冷凍損傷的關鍵機制，UC-MSCs和MSC-EVs可有效抑制鐵死亡，改善卵泡存活、促進血管生成并恢復移植后卵巢內分泌與生育功能。該研究為提升卵巢組織冷凍移植成功率提供了新的治療策略。
在生殖醫學領域，卵巢組織冷凍保存是保護女性生育力的重要“火種”保存技術，尤其適用于患有癌癥、需立即接受化療的青春期前女孩和育齡女性。然而，這個充滿希望的技術在現實中卻面臨著一個嚴峻的“阿喀琉斯之踵”：冷凍和解凍過程本身會對嬌嫩的卵巢組織造成顯著損傷，導致移植后大量的原始卵泡因缺血缺氧而丟失，最終影響移植物的長期存活和功能恢復。這種冷凍損傷的具體機制尚不完全明確，也缺乏高效的治療手段來“修復”受損的組織，從而限制了該技術在臨床的廣泛應用。為了突破這一瓶頸，尋找能夠有效修復卵巢冷凍損傷、提升移植成功率的治療策略，成為了一個亟待解決的科學與臨床問題。
近期發表于《Materials Today Bio》的一項研究，為我們揭示了冷凍損傷背后一個此前未被充分認知的關鍵“元兇”——鐵死亡，并同時提供了兩種極具前景的“修復工具”：源自人臍帶的間充質干細胞及其分泌的外泌體。這項研究不僅深化了我們對卵巢冷凍損傷機制的理解，更為臨床改善生育力保存結局開辟了新的方向。
為了深入探究這一問題，研究人員主要運用了以下幾項關鍵技術：首先，他們建立了小鼠卵巢組織的冷凍-復蘇及三維體外培養模型，并在此基礎上設置了包括新鮮對照組、冷凍組、干細胞共培養組、外泌體處理組以及使用鐵死亡誘導劑和抑制劑在內的多個實驗組進行對比。其次，利用RNA測序技術對冷凍前后的卵巢組織進行轉錄組分析，篩選關鍵通路。再者，通過透射電鏡、納米顆粒追蹤分析和蛋白質印跡法對分離得到的外泌體進行表征鑒定。此外，研究還綜合運用了免疫組織化學、蛋白質印跡、實時熒光定量PCR、鐵離子和谷胱甘肽比色測定、C11-BODIPY脂質過氧化熒光探針染色、末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記法等多種分子與生化檢測技術，系統評估了鐵死亡相關指標、血管生成、細胞凋亡及卵泡形態。最后，通過將經不同處理的卵巢組織移植至去勢小鼠腎包膜下，并利用超聲多普勒、組織學分析和激素檢測等手段，在體評估了移植物的血液灌注、存活情況及內分泌功能。
3.1. 冷凍誘導卵巢組織發生鐵死亡相關的分子和生化改變
RNA測序分析發現，冷凍后的卵巢組織有大量基因表達發生改變，其中鐵死亡被確定為關鍵調控通路。具體表現為：關鍵的鐵死亡抑制蛋白谷胱甘肽過氧化物酶4表達下調，而促進脂質過氧化的長鏈脂酰輔酶A合成酶4表達上調。生化檢測進一步證實，冷凍組織內二價鐵離子水平升高，還原型谷胱甘肽含量耗竭，同時C11-BODIPY染色顯示脂質過氧化水平顯著增強。這些變化與使用經典鐵死亡誘導劑伊拉司亭處理新鮮卵巢組織所誘導的表型一致，從而確證鐵死亡是卵巢冷凍損傷的一個重要機制。
3.2. 臍帶間充質干細胞通過抑制鐵死亡減輕卵巢損傷
與冷凍組相比，與臍帶間充質干細胞共培養的卵巢組織，其GPX4蛋白表達和GSH水平得到恢復，ACSL4表達和Fe2+水平則顯著降低，脂質過氧化也受到明顯抑制。這些改善效果與使用鐵死亡特異性抑制劑Fer-1處理的效果相似，且兩者在促進血管生成（表現為CD31陽性微血管密度和促血管生成因子VEGF、ANG2、IGF1表達增加）方面也效果相當。這提示，抑制鐵死亡是臍帶間充質干細胞發揮卵巢保護作用的核心機制之一。
3.3. 臍帶間充質干細胞外泌體的表征及其被冷凍卵巢組織的攝取
研究人員成功從臍帶間充質干細胞培養上清中分離出外泌體。透射電鏡顯示其為典型的杯狀雙層膜結構，納米顆粒追蹤分析顯示粒徑主要分布在100納米左右，蛋白質印跡證實其表達外泌體標志蛋白CD9、CD81和Alix，而不表達陰性標志物Calnexin。用熒光染料PKH26標記外泌體后與冷凍卵巢組織共培養，發現外泌體可被卵巢組織有效攝取，熒光信號在培養第4天達到峰值。
3.4. 臍帶間充質干細胞外泌體促進冷凍卵巢組織的血管生成并抑制細胞凋亡
在體外培養體系中，與外泌體共培養的冷凍卵巢組織，其卵泡結構更完整，健康卵泡（尤其是原始和初級卵泡）比例更高，卵泡閉鎖減少。同時，組織內的微血管密度顯著增加，細胞凋亡水平明顯下降。這些積極效果與使用Fer-1抑制劑處理的效果相近，表明外泌體具有與細胞相似的修復能力。
3.5. 臍帶間充質干細胞外泌體通過抑制鐵死亡減輕冷凍誘導的卵巢損傷
機制探究發現，外泌體處理同樣能上調GPX4、下調ACSL4，降低組織內Fe2+水平，提升GSH含量，并有效抑制脂質過氧化。其調節鐵死亡相關指標的效果與Fer-1處理組無顯著差異。這證明，臍帶間充質干細胞外泌體修復卵巢冷凍損傷的作用，同樣是通過抑制鐵死亡通路來實現的。
3.6. 臍帶間充質干細胞及其外泌體促進冷凍卵巢移植后卵泡存活并減少凋亡
將經過不同預處理的冷凍卵巢組織移植到小鼠腎包膜下。結果顯示，無論是臍帶間充質干細胞還是其外泌體預處理，都能在移植后早期（第3天和第7天）提高移植卵巢中健康卵泡的數量和原始卵泡的比例，并顯著降低組織中的細胞凋亡水平。兩者效果相當，且均接近新鮮卵巢移植組的水平。
3.7. 臍帶間充質干細胞及其外泌體增強冷凍卵巢移植物內的血液灌注
移植后通過超聲多普勒監測移植物血液灌注情況。在移植后第3天，干細胞和外泌體處理組的移植物血流恢復率高達90%，而單純冷凍組僅為30%。到第7天，處理組基本實現完全血流恢復，而冷凍組仍有部分移植物灌注不全。這表明兩者都能有效促進移植后的血管再生。
3.8. 臍帶間充質干細胞及其外泌體改善冷凍卵巢移植物的激素分泌和生育潛力恢復
在移植后第7天，干細胞和外泌體處理組小鼠血清中的抗苗勒管激素水平顯著高于冷凍組，且干細胞處理組的雌二醇水平也更高。在評估卵母細胞發育潛能時，從體外培養卵巢中獲取的GV期卵母細胞，在干細胞或外泌體預處理后，其體外成熟率、孤雌激活率以及后續的2細胞胚胎形成率均較冷凍組有顯著提升，甚至有個別胚胎能發育至囊胚階段，而冷凍組則完全未能形成囊胚。這說明兩種處理能部分恢復卵母細胞的成熟和早期發育能力。
綜上所述，本研究得出的核心結論是：鐵死亡是卵巢組織冷凍損傷的一個關鍵機制。人臍帶來源的間充質干細胞及其分泌的外泌體，能夠通過抑制鐵死亡（表現為上調GPX4、下調ACSL4、降低Fe2+和脂質過氧化、恢復GSH），有效修復冷凍損傷的卵巢組織。在功能上，它們能促進血管新生、提高卵泡存活率、減少細胞凋亡，并改善移植后卵巢的內分泌功能和卵母細胞的發育潛能。尤為重要的是，外泌體展現了與母細胞相當的療效，這為其作為一種無細胞的、更易于儲存和標準化的納米級治療策略應用于臨床提供了實驗依據。
在討論中，作者強調了該發現的科學意義與轉化價值。這不僅首次將鐵死亡與卵巢冷凍損傷明確關聯，為理解冷凍損傷的分子機制提供了新視角，而且驗證了靶向鐵死亡的有效性。研究結果支持臍帶間充質干細胞外泌體作為臍帶間充質干細胞的潛在替代或補充療法，用于提升卵巢組織冷凍保存和移植的成功率，為生育力保存領域帶來了新的希望。當然，作者也指出了研究的局限性，如小鼠模型與人類卵巢的差異、未能解析外泌體中具體的活性成分（如特定 miRNA），以及未來臨床轉化中需要解決的劑量標準化、長期安全性評估和遞送策略優化等問題。盡管如此，這項研究無疑為開發更高效、安全的生育力保護輔助治療策略奠定了重要的理論基礎。
