《Environmental Microbiology Reports》：Relative Humidity Influences Aureobasidium pullulans Degradation of Polyester Polyurethane Foam
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本文探討了環(huán)境相對濕度（Equilibrium Relative Humidity, ERH）對植物病原真菌Aureobasidium pullulans降解聚酯型聚氨酯（Polyester Polyurethane, PU）泡沫的影響。研究通過重量損失、掃描電子顯微鏡（SEM）成像、轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）和Impranil酶解試驗證實，高ERH（85%和100%）顯著增強了PU泡沫的降解程度，并上調(diào)了角質(zhì)酶（Cutinase）等降解相關(guān)基因的表達，為從環(huán)境濕度調(diào)控角度預(yù)防或促進塑料的生物降解提供了新見解。
引言
聚氨酯（Polyurethane）因其可定制化的剛性或柔性結(jié)構(gòu)，被廣泛用于家居、汽車、船舶和飛機等領(lǐng)域的絕緣材料、家具、涂料、粘合劑和服裝等。由于聚合物中存在無定形區(qū)域，使其容易受到微生物的侵蝕。由微生物活動引發(fā)的腐蝕每年造成數(shù)十億美元的經(jīng)濟損失，其中部分源于塑料的降解。真菌的生長依賴于水分，但目前對平衡相對濕度（Equilibrium Relative Humidity, ERH）如何影響塑料降解的認知尚不充分。本研究旨在量化ERH對植物病原真菌Aureobasidium pullulans降解聚酯型聚氨酯（Polyester Polyurethane）泡沫的影響，并識別潛在的相關(guān)遺傳途徑。
Aureobasidium pullulans是一種普遍存在的多態(tài)性真菌，是典型的腐生真菌。它通過分泌多種酶分解周圍環(huán)境中的分子，其中角質(zhì)酶（Cutinase）能夠斷裂角質(zhì)（植物蠟質(zhì)保護層）中的酯鍵，這類酯鍵同樣存在于塑料聚合物的碳骨架中，這使得A. pullulans有可能利用角質(zhì)酶降解塑料。同時，水分是微生物驅(qū)動降解的關(guān)鍵，高相對濕度可上調(diào)真菌基因表達，包括與次級代謝物和過敏原產(chǎn)生相關(guān)的基因，并參與聚合物的水解過程。然而，ERH如何影響A. pullulans對聚氨酯的降解及其相關(guān)的角質(zhì)酶基因表達途徑，目前尚未可知。
本研究的目標是評估相對濕度如何影響A. pullulans降解聚酯型聚氨酯泡沫，并解析相關(guān)的生化途徑。實驗使用了從飛機和室內(nèi)灰塵中分離出的三株環(huán)境A. pullulans菌株（AFRL64, AFRL76, OSU3）。
材料與方法
首先進行菌株篩選，基于Impranil（一種聚酯-聚氨酯）酶解圈試驗，挑選出三株具有降解潛力的菌株。實驗使用了商業(yè)藍色聚酯型聚氨酯泡沫，切割并清洗后，將泡沫塊稱重，嵌入Difco馬鈴薯葡萄糖肉湯粉末作為模擬灰塵的營養(yǎng)源，通過霧化接種A. pullulans孢子。
濕度控制在50%、85%和100% ERH水平，通過鹽溶液（MgCl2、NaCl）或去離子水調(diào)控孵育罐內(nèi)的濕度。所有樣品在25°C下分別孵育1周和2周。
孵育結(jié)束后，通過重量損失評估降解程度，并對泡沫進行清洗、干燥和再次稱重。同時，通過掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscopy, SEM）對孵育后的泡沫（有真菌生長和清洗后）進行成像，觀察真菌生長和泡沫表面的物理變化。
為了評估外部碳源對降解的影響，還設(shè)置了營養(yǎng)可利用性實驗，對比了含碳（馬鈴薯葡萄糖肉湯）和不含碳（最低限度培養(yǎng)基）的營養(yǎng)源對真菌生長（通過定量PCR (qPCR) 檢測18S rRNA基因拷貝數(shù)）的影響。
通過提取孵育后樣品中的總RNA，進行RNA測序（RNA sequencing, RNA-seq），以分析不同ERH條件下基因表達的差異，特別是與角質(zhì)酶相關(guān)的基因。對菌株AFRL64的特定角質(zhì)酶基因進行了克隆，并在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21 (DE3) 中表達，隨后在添加了Impranil的平板上評估其水解能力。
結(jié)果
- 1.
重量損失與營養(yǎng)評估
孵育1周和2周后，泡沫質(zhì)量較接種前均出現(xiàn)顯著下降（配對t檢驗p < 0.0001）。較高的ERH與聚氨酯泡沫的百分比重量損失增加顯著相關(guān)（ANOVA p = 0.0002）。在所有菌株中，100% ERH下觀察到最大的重量損失。與50% ERH的樣品相比，100%和85% ERH的樣品重量損失顯著更高（Tukey-Kramer成對比較p < 0.001 和 p = 0.007）。在100% ERH下，2周孵育的樣品比1周顯示出更高的重量損失百分比（p = 0.002）。另一方面，在不同ERH水平下，通過qPCR檢測的真菌生長量，在添加最低限度培養(yǎng)基（無外源碳）和馬鈴薯葡萄糖肉湯（有碳）的泡沫樣品之間沒有顯著差異，這表明泡沫本身可能提供了足夠的碳源。
- 2.
掃描電子顯微鏡（SEM）成像
SEM圖像清晰地顯示了真菌生長和泡沫降解的跡象。未經(jīng)處理的清潔泡沫表面光滑，沒有凹坑或撕裂。在50%和85% ERH下，真菌細胞呈圓形附著在泡沫上，而在100% ERH下，真菌細胞形成生物膜覆蓋泡沫表面。更重要的是，在清洗掉真菌后的泡沫表面圖像中，觀察到明顯的降解跡象。對于菌株AFRL64和AFRL76，在100% ERH下清洗后的泡沫表面出現(xiàn)了裂紋和孔洞。而菌株OSU3在50%和100% ERH下清洗后的泡沫表面均出現(xiàn)了凹坑。這些視覺證據(jù)表明A. pullulans在降解泡沫，且最高的泡沫降解發(fā)生在100% ERH。
- 3.
基因組大小與角質(zhì)酶基因鑒定
三株A. pullulans的基因組大小存在顯著差異：AFRL64為27 Mb，AFRL76為77 Mb，OSU3為49 Mb。通過基因功能注釋，在三株菌中總共預(yù)測到10個角質(zhì)酶基因。AFRL64和OSU3各含有2個獨特的推定角質(zhì)酶基因，而AFRL76含有6個。其中，AFRL64的角質(zhì)酶1與AFRL76的角質(zhì)酶7序列相同，AFRL64的角質(zhì)酶2與AFRL76的角質(zhì)酶5相同。這些角質(zhì)酶可分為長基因（約1896-2574堿基對）和短基因（約666-678堿基對）兩類。基因表達熱圖分析顯示，大部分角質(zhì)酶基因在85%或100% ERH下的轉(zhuǎn)錄本計數(shù)最高。其中，長角質(zhì)酶基因（如角質(zhì)酶1和7）在較高ERH下的表達量顯著增加。
- 4.
角質(zhì)酶的表達與酶活驗證
對AFRL64的兩個角質(zhì)酶基因（角質(zhì)酶1和角質(zhì)酶2）進行了克隆并在大腸桿菌中表達。在含有1% Impranil的平板上，表達AFRL64角質(zhì)酶2基因的E. coli菌落周圍出現(xiàn)了清晰的水解圈（halo），表明該酶具有水解聚酯-聚氨酯的能力。而表達角質(zhì)酶1基因或空載體的對照菌落則沒有出現(xiàn)水解圈。這為AFRL64的短角質(zhì)酶（角質(zhì)酶2）能夠降解聚氨酯類化合物提供了初步證據(jù)。
討論
本研究證實，ERH是影響A. pullulans降解聚酯型聚氨酯泡沫的關(guān)鍵環(huán)境因素。較高的ERH與更顯著的泡沫重量損失、SEM圖像中更清晰的降解跡象以及角質(zhì)酶基因表達的上調(diào)相關(guān)聯(lián)。A. pullulans作為腐生真菌，依賴水作為酶和可溶性單體的運輸介質(zhì)，因此濕度的增加可能促進了降解過程。
本研究的發(fā)現(xiàn)具有雙重應(yīng)用意義。一方面，在需要防止塑料降解的環(huán)境（如飛機、建筑材料），可通過控制環(huán)境濕度（降低ERH）來抑制A. pullulans等真菌的生長及其降解酶的表達，從而延長材料壽命，降低維護成本。另一方面，在希望促進塑料生物降解的場合（如垃圾填埋場），則可利用較高的濕度環(huán)境來加速聚氨酯等塑料的分解，為塑料污染治理提供一種潛在的生物解決方案。
此外，研究也揭示了所測試菌株間的遺傳多樣性，包括基因組大小和角質(zhì)酶基因數(shù)量的差異，這可能與它們在不同環(huán)境中的適應(yīng)性和降解效率有關(guān)。
局限性
本研究存在一定局限性，包括測試的菌株數(shù)量有限、孵育時間相對較短、以及實驗在受控條件下進行，未能完全模擬自然環(huán)境中溫度、濕度、光照波動以及微生物群落相互作用等復(fù)雜因素。SEM成像和重量損失提供了降解的間接證據(jù)，角質(zhì)酶基因的表達上調(diào)與降解相關(guān)，但未通過放射性標記等方法直接證明角質(zhì)酶蛋白的產(chǎn)生與泡沫質(zhì)量損失之間的因果關(guān)系。此外，除了角質(zhì)酶，其他酶類如漆酶（Laccase）、脂肪酶（Lipase）等也可能參與了降解過程。
結(jié)論
本研究明確了ERH對A. pullulans降解聚氨酯泡沫的促進作用。高ERH（85%和100%）導(dǎo)致更高的真菌生物量、更顯著的泡沫重量損失和表面結(jié)構(gòu)破壞，并上調(diào)了潛在的降解酶——角質(zhì)酶基因的表達。從菌株AFRL64中鑒定出的一個短角質(zhì)酶基因（角質(zhì)酶2）在大腸桿菌中表達后，展現(xiàn)出了水解聚氨酯類似物Impranil的能力。未來研究可關(guān)注更長的孵育時間、以及其他環(huán)境因子（如溫度、光照、氧氣）對降解過程的影響。這些知識將有助于設(shè)計更可持續(xù)的材料使用策略和環(huán)境管理方案，無論是在需要保護塑料制品的建筑領(lǐng)域，還是在需要加速塑料廢棄生物降解的環(huán)保領(lǐng)域。
