《Neuroscience》：A proteomics-based approach reveals the role of the activation of astrocytes with the A1 phenotype in medullary neuroinflammation after TBI in mice
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星形膠質細胞活化介導的神經炎癥是創傷性腦損傷（TBI）后腦干（MO）繼發性損傷的關鍵機制。通過蛋白質組學分析發現UCP2、FBXW5、ADIPOR2等48個差異蛋白參與炎癥調控，其中FBXW5和ADIPOR2呈現時間依賴性表達變化，為法醫推斷TBI時間提供了分子依據。
陳志杰|李明明|王河南|孫夢北|馬家琪|司婷|程新諾|李珊珊|陳光|徐翔
安徽醫科大學皖南醫學院法醫學系，中國蕪湖市弋江區文昌西路22號，241000
摘要
創傷性腦損傷（TBI）后延髓（MO）中繼發性損傷的機制尚不明確，這促使人們探索MO中星形膠質細胞表型變化與TBI后神經炎癥之間的關系，為TBI的發病機制提供了新的見解。在本研究中，C57BL/6J小鼠被隨機分為對照組和閉合性TBI組。通過生理參數監測和心臟超聲評估TBI后的病理生理變化。我們利用蛋白質組學技術鑒定差異表達蛋白（DEPs），并分析損傷的繼發性機制。采用蘇木精-伊紅（HE）染色觀察TBI后MO皮質和腹側區域的形態變化。通過Western blotting檢測IL-1β、TNF-α、GFAP、C3（A1）和S100A10（A2）的蛋白表達水平。通過免疫熒光評估星形膠質細胞的分布和極化情況。蛋白質組學分析顯示TBI后MO發生了多種繼發性變化。在48個共同DEPs中，UCP2、FBXW5和ADIPOR2被發現能夠調節炎癥。TBI降低了呼吸頻率、射血分數和縮短分數。HE染色顯示腹側MO出現水腫、神經元嗜酸性粒細胞增多以及星形膠質細胞胞質紅色染色。Western blotting和免疫熒光證實腹側MO中IL-1β和TNF-α表達增加以及神經毒性反應性星形膠質細胞的激活。綜上所述，神經毒性反應性星形膠質細胞的激活介導了TBI后的急性MO損傷。FBXW5和ADIPOR2在損傷后的表達隨時間發生變化。這些發現為法醫學中的TBI時間進程提供了分子基礎，并對急性炎癥階段和TBI后損傷進展的機制提供了新的見解。
引言
創傷性腦損傷（TBI）是全球導致死亡和殘疾的主要原因之一，過去十年其發病率逐年上升（?olescu等人，2020年）。據估計，全球每年約有6900萬人遭受不同程度的TBI，中國的情況同樣不容樂觀（Dewan等人，2019年；Jiang等人，2019年；Maas等人，2022年）。根據臨床格拉斯哥昏迷量表（GCS）評分的不同，TBI分為輕度、中度和重度類型（Capizzi等人，2020年）。中度TBI引起的復雜病理生理過程，如繼發性腦水腫、神經炎癥和氧化應激，可能持續數小時至數年，并逐漸累積，嚴重影響患者預后（Godoy等人，2016年）。TBI后的7天內涉及急性炎癥、繼發性損傷進展和修復過程啟動的關鍵節點，包括早期血腦屏障（BBB）破壞、炎癥、氧化應激爆發和膠質細胞激活-浸潤級聯反應（Karve等人，2016年；Taib等人，2017年；Izzy等人，2019年）。這一時期繼發性腦水腫或神經源性肺水腫的癥狀最為嚴重，且與死亡密切相關（Winkler等人，2016年；Hu等人，2017年）。
神經炎癥是一種繼發于TBI后腦損傷的分子病理過程，在分子水平上廣泛影響患者的預后。促炎機制主要由小膠質細胞和星形膠質細胞釋放各種促炎因子（如IL-1β和TNF-α）來介導（Sulhan等人，2020年）。此外，NOD樣受體家族的pyrin結構域包含3（NLRP3）炎性小體也被激活，促進caspase-1的切割，進而誘導IL-1β的產生，從而引發炎癥反應（He等人，2024b）。此外，BBB的完整性受損，血液成分和外周免疫細胞進入腦實質，進一步加劇神經炎癥。過度或長期的神經炎癥可能導致嚴重的神經學后果（Jassam等人，2017年）。作為腦干的重要組成部分，延髓（MO）的初級損傷常常導致快速死亡（Goodchild和Moon，2009年；Siacca等人，2019年）。我們之前的研究表明，TBI后小鼠遠端腦區的MO代謝譜發生顯著改變，神經炎癥可能是MO繼發性損傷的病理生理機制（He等人，2024a）。
作為神經系統中的主要膠質細胞類型，星形膠質細胞具有多種功能，包括神經遞質穩態調節、離子穩態調節和BBB維護，這些細胞還參與神經回路的形成（Sofroniew和Vinters，2010年；Clarke和Barres，2013年；Zhou等人，2020年）。近年來，針對不同腦損傷和腦缺血模型中星形膠質細胞表型變化的研究日益增多；例如，對系統性炎癥小鼠模型的單細胞測序和空間轉錄組學研究表明，炎癥在不同表型的星形膠質細胞中引發了廣泛的反應，這些細胞在解剖位置上存在顯著異質性（Hasel等人，2021年）。另一個例子是，TBI后星形膠質細胞會反應性增殖，并參與損傷周圍組織的損傷和修復。除了上述功能外，MO中的星形膠質細胞還調節產生呼吸節律的回路活動，從而影響運動能力（Sheikhbahaei等人，2018年）。在兩種不同的星形膠質細胞功能表型中，神經毒性反應性星形膠質細胞（A1表型）主要由小膠質細胞釋放IL-1α、TNF和補體C1q形成，發揮神經毒性作用（如炎癥反應）并誘導神經元死亡；而神經營養反應性星形膠質細胞（A2表型）主要由中樞神經系統缺血損傷刺激形成，發揮神經保護作用，如突觸形成、神經發生、BBB修復和膠質細胞瘢痕形成（Liddelow等人，2017年；Su等人，2019年；Czy?ewski等人，2024年）。然而，TBI后MO中星形膠質細胞的特定表型及其與神經炎癥的關系仍不清楚。
近年來，多組學技術被廣泛應用于TBI相關研究，其中蛋白質組學技術發揮了重要作用（Kocheril等人，2022年）。例如，Khalil Mallah等人利用空間分辨的微蛋白質組學技術分析了TBI后不同階段的蛋白質動態變化，并報告與帕金森病相關的蛋白質異常表達（Mallah等人，2019年）。此外，Shi-Xiang Cheng等人利用基于iTRAQ的定量蛋白質組學技術分析了接受治療性低溫處理的TBI模型小鼠的蛋白質變化，鑒定出四種關鍵蛋白質（包括纖溶酶原（PLG），這些蛋白質可緩解神經元壞死和水腫（Cheng等人，2018年）。在本研究中，我們使用Orbitrap Astral高分辨率質譜儀在數據獨立采集（DIA）模式下分析了TBI后7天內的差異蛋白質表達，以識別與TBI后MO中神經炎癥相關的蛋白質變化。通過生物特征分析和分子生物學技術證實了該區域星形膠質細胞表型變化與神經炎癥（一種繼發性損傷機制）之間的關聯，從而為TBI后MO中的神經炎癥機制提供了新的見解。
動物
共購買了105只SPF級雄性C57BL/6J小鼠（體重26±2克），年齡在12-13周之間，來自河南Skibbes生物技術有限公司。所有小鼠在送達后均在動物飼養室適應了一周，然后被隨機分配到不同的實驗組。動物飼養室的溫度保持在23±2°C，光照和黑暗時間各12小時，所有實驗動物均可自由獲取食物和水。
差異表達蛋白的鑒定
主成分分析（PCA）的結果顯示，TBI后1小時、1天、3天和7小時時，MO與對照組相比具有明顯的邊界，不同處理組之間也觀察到不同的特征，這表明MO腦區的病理生理變化隨時間發生（圖2A）。我們將TBI后的四個階段分為急性炎癥期（TBI_1h和TBI_1d組）。
討論
我們之前的研究表明，TBI后MO在三個階段（急性期、亞急性期和慢性期）的代謝譜發生了改變（He等人，2024a）。這些觀察結果表明存在神經炎癥，這可能是MO損傷的潛在機制；此外，膠質細胞激活參與了神經炎癥過程。與大多數關注TBI后大腦直接損傷區域的研究不同，本研究采用了蛋白質組學技術
結論
總之，本研究分析了TBI后急性炎癥期和損傷進展期間MO中的差異表達蛋白（DEPs），并確定了與這些DEPs相關的生物過程。FBXW5和ADIPOR2在損傷后的表達具有時間依賴性，為法醫學中推斷TBI損傷時間提供了參考數據。此外，我們的結果表明A1型星形膠質細胞主要存在于腹側MO，可能參與其中的過程
作者貢獻聲明
陳志杰：撰寫——審閱與編輯、撰寫——初稿、軟件使用、方法學、數據分析、數據管理。李明明：撰寫——審閱與編輯、撰寫——初稿、軟件使用、方法學、數據分析、數據管理。王河南：數據可視化、方法學、數據分析。孫夢北：數據可視化、方法學、數據分析。馬家琪：數據可視化、方法學、數據分析、概念化。司婷：資源獲取、實驗設計。程新諾：資源獲取。
利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文所述的工作。
致謝
我們感謝安徽代謝性疾病藥物基礎研究創新中心（位于中國蕪湖皖南醫學院，241002）的Che Hui團隊提供的實驗室設備。同時，我們也感謝free online Majorbio Choud Platform（cloud.majorbio.com）在蛋白質組數據處理方面的支持，以及BioRender.com在本文科學圖標制作方面的幫助。
