癌癥治療的未來在于“量體裁衣”，即精準腫瘤學。想象一下，醫生能夠像讀取腫瘤的“基因藍圖”一樣，通過一項名為綜合基因組分析（Comprehensive Genomic Profiling, CGP）的技術，一次性掃描數百個癌癥相關基因，找出驅動癌癥生長的關鍵“開關”（即驅動基因突變），從而為患者匹配最有效的靶向藥物。這項技術自2019年起已被日本國家醫療保險系統覆蓋，用于晚期實體瘤患者，迄今已有超過10萬患者從中受益。然而，在通往完美“藍圖解讀”的道路上，一個巨大的絆腳石橫亙在眼前：意義不明確變異（Variants of Uncertain Significance, VUS）。

VUS就像是基因藍圖上的“模糊筆跡”——檢測到了變化，但現有知識無法明確判斷它是會導致癌癥的“壞開關”（致病），還是對健康無礙的“背景雜音”（良性）。在傳統的、針對有強家族史患者的BRCA1/2基因（遺傳性乳腺癌卵巢癌綜合征的關鍵基因）檢測中，VUS問題已存在，但在CGP的應用中，這個問題被急劇放大。CGP以不依賴于癌癥類型（腫瘤不可知）的方式進行檢測，并且能同時發現遺傳性和體細胞變異，這使得BRCA1/2基因VUS的檢出率遠高于傳統檢測，高達75%以上。如此大量的VUS不僅阻礙了基于BRCA1/2突變（可預測對鉑類化療或PARP抑制劑敏感性）的治療決策，也為遺傳咨詢和家系篩查帶來了巨大困擾。如何從海量VUS中，有效、快速地識別出那些潛在有害、值得深入功能驗證的變異，成為臨床實踐和轉化研究中亟待解決的問題。

為了應對這一挑戰，來自日本廣島大學醫院及其合作機構的研究人員開展了一項研究，旨在分析真實世界CGP數據中的BRCA1/2變異圖譜，并開發一個整合計算預測與功能證據的框架，來系統性地優先排序VUS。他們的研究成果發表在《European Journal of Human Genetics》期刊上。這項研究的意義在于，它為解決CGP時代VUS泛濫的臨床困境提供了一個概念驗證性的實用流程，該流程不僅提升了BRCA1/2 VUS的解讀效率，其方法論也具備推廣至其他遺傳性癌癥易感基因評估的潛力。

為了開展研究，研究者利用了2019年9月至2025年7月期間，在日本廣島大學醫院及其附屬合作醫院完成的2172例CGP檢測數據。這些檢測涵蓋了多種臨床批準的CGP平臺，樣本來源包括腫瘤組織或血漿游離DNA。研究首先對識別出的所有BRCA1/2變異進行篩選，排除已知致病/良性變異、人群等位基因頻率高于0.1%的變異等，最終得到153個候選VUS用于后續分析。核心的分析方法在于整合了10種計算（in silico）預測工具（CADD, SIFT, PolyPhen-2, SpliceAI, REVEL, BayesDel, MetaSVM, PrimateAI, phyloP100, MaxEntScan），利用從Franklin工具衍生的數值閾值對這些VUS進行致病性評分和初步篩選。對于被預測為潛在有害的變異，研究人員進一步查閱文獻和公共數據庫，尋找已有的功能學證據。對于缺乏現有功能證據的關鍵候選變異，研究者則進行了后續的功能實驗驗證。在針對BRCA2:c.67 G>C (p.D23H)的功能分析中，他們使用了從患者血液中提取的RNA，通過逆轉錄-聚合酶鏈式反應和Sanger測序，在患者體內驗證了該變異引起的剪接異常。

通過對2172例CGP檢測的分析，研究共鑒定出526個BRCA1/2變異，其中396個（75.3%）被歸類為VUS。致病性變異既出現在經典的HBOC相關癌癥（如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌）中，也有36%出現在非經典HBOC相關癌癥中。而VUS則主要（68.4%）出現在非經典HBOC相關癌癥中。這些VUS廣泛分布在基因的各個功能域，凸顯了對VUS致病性進行重新評估的重要性。經過初步篩選，153個VUS被選為后續計算分析候選。

研究團隊應用了10種計算預測工具對153個VUS進行評分。結果顯示，絕大多數變異未超過預設的致病性閾值。在交叉比較中，共有39個變異（25.5%）被至少一種預測工具預測為致病。值得注意的是，SIFT預測了37個變異為致病，但其中29個未得到其他預測工具的支持，表明SIFT單獨使用的特異性不足。在排除了這些僅被SIFT支持的變異后，最終有10個VUS被優先選出用于進一步的功能解讀，包括2個剪接位點變異和8個錯義變異。

在10個優先變異中，BRCA1:c.5107 T>A (p.Y1703N), BRCA2:c.7523 G>A (p.G2508D) 和 BRCA2:c.7795 G>A (p.E2599K) 在已發表的同源重組修復（HDR）或飽和基因組編輯（SGE）功能實驗中已被證明具有有害效應。相反，BRCA2:c.7522 G>A (p.G2508S) 和 c.8437 G>C (p.G2813R) 在功能實驗中顯示為中性。BRCA1:c.241 C>G (p.Q81E) 在SGE數據中顯示為中等活性，可能是一個功能減弱的等位基因。BRCA2:c.3044 A>T (p.K1015M) 在現有大規模功能數據中缺乏注釋。BRCA2:c.67 G>C (p.D23H) 在近期研究中已被體外實驗提示有害，但其體內臨床證據和具體致病機制尚不明確，因此被選作深入研究的典型案例。

BRCA2:c.67 G>C位于外顯子2/內含子2邊界，計算預測（SpliceAI）提示其可能導致異常剪接。為了在人體內驗證這一點，研究人員對攜帶該變異患者的血液RNA進行了RT-PCR分析。結果顯示，與健康對照相比，患者樣本中出現了更小的擴增片段。對該片段的Sanger測序證實，發生了外顯子2的完全跳躍。由于外顯子2包含翻譯起始位點，其跳躍將導致BRCA2蛋白功能喪失，這從分子機制上解釋了該變異的致病性。

本研究的結論和討論強調了CGP極大地擴展了BRCA1/2檢測的臨床場景，但也導致了VUS數量的激增，這已成為影響精準治療實施和遺傳咨詢的主要瓶頸。研究團隊為此提出了一個創新的、可操作的解決方案：一個整合了多種計算預測工具的過濾和優先排序框架。這個框架并非用于直接的ACMG/AMP臨床分類，而是作為一個上游篩選工具，從海量VUS中高效地“打撈”出最值得進行下游功能驗證的候選者。與僅使用ENIGMA（Evidence-based Network for the Interpretation of Germline Mutant Alleles）專家組指定的兩種預測工具（BayesDel和SpliceAI）的策略相比，本研究的“十工具”框架識別出了額外的、已被大規模功能實驗證實有害的變異，顯示了其更廣的覆蓋面和更高的靈敏度。

研究通過對BRCA2:c.67 G>C的深入剖析，完美演繹了這一框架的價值。它不僅通過患者來源RNA的RT-PCR和測序，在體內直接證實了預測的外顯子2跳躍現象，提供了PS1（剪接）_中等強度的證據，還通過兩名攜帶此變異患者的臨床數據（分別對鉑類化療和PARP抑制劑聯合治療表現出敏感性），提供了支持同源重組缺陷（HRD）表型的臨床證據。這為最終將該變異重新分類為致病性提供了強有力的多維度支持。這個案例表明，將CGP產生的真實世界臨床數據、計算預測與功能實驗證據相結合，是解決VUS臨床解讀難題的有效途徑。

這項研究的重要意義在于，它首次在大型真實世界CGP隊列中系統描繪了BRCA1/2 VUS的圖譜，并開發并驗證了一個概念性的優先排序框架。這個框架具有普適性，其核心邏輯——利用計算工具進行高效初篩，再結合功能與臨床證據進行深度解讀——可以推廣至Lynch綜合征（林奇綜合征）相關的錯配修復基因或其他遺傳性癌癥易感基因的VUS評估中，從而在更廣泛的層面上提升CGP的臨床效用。盡管研究存在單中心隊列、功能驗證范圍有限等局限性，但它為加速VUS的臨床解讀、連接基因組圖譜與臨床決策，邁出了堅實而關鍵的一步，為未來的多中心協作和國際數據庫整合奠定了基礎。