植物能夠從離體葉片中通過細胞重編程形成多能性愈傷組織。然而，盡管具有多能性，但迄今為止，從葉片愈傷組織再生的器官大多局限于常規的枝條和根，其再生其他特化器官的潛力尚不清楚。在本研究中，我們發現匍匐莖可以從馬鈴薯葉片愈傷組織中再生。進一步研究表明，農桿菌刺激能夠高效地誘導馬鈴薯葉片愈傷組織再生匍匐莖及其后續的塊莖發育。當去除細菌培養物的生物活性后，匍匐莖再生的誘導效應消失，表明該過程需要活的細菌細胞。通過使用不同菌株的比較實驗，我們發現C58染色體背景對于這種增強作用是必需的。整合轉錄組分析和轉基因功能驗證，我們發現磷脂酰乙醇胺結合蛋白家族基因密切參與了這一響應。此外，我們觀察到病毒不易通過愈傷組織擴散到再生的匍匐莖，因為愈傷組織缺乏連續的維管系統作為病毒移動的通道。我們的研究結果表明，細菌刺激能從多能性葉片愈傷組織中觸發匍匐莖再生，為生產無病毒的馬鈴薯塊莖提供了一種潛在方法。

從馬鈴薯枝條獲取的節段插條，在含高蔗糖的培養基上、黑暗條件下培養，可誘導節部發育匍匐莖。我們假設，在添加了常規枝條再生所需植物激素的類似培養條件下，馬鈴薯葉片愈傷組織也能激活類似的器官發生過程。我們將此培養基命名為匍匐莖誘導培養基。實驗證實，具有細長假莖、鉤狀尖端且無葉綠素的匍匐莖樣組織確實可直接從葉片愈傷組織再生，盡管在此條件下效率較低。更重要的是，這些組織大多后續發育成了塊莖，因此我們稱其為再生匍匐莖樣組織。我們隨后嘗試通過將馬鈴薯葉片外植體與攜帶pCAMBIA1301 GUS表達載體的農桿菌GV3101菌株共培養，以期從匍匐莖樣組織產生轉基因塊莖。出乎意料的是，與未處理和僅培養基對照組相比，葉片愈傷組織形成匍匐莖樣組織的效率急劇增加。值得注意的是，即使是不含二元載體的GV3101也能促進匍匐莖樣組織的形成，這表明農桿菌與馬鈴薯葉片外植體之間的相互作用在這種條件下激活了匍匐莖樣器官發生。雖然GV3101預處理導致了匍匐莖樣組織的強力誘導，但約70%–90%的再生組織是非轉基因的。這些發現支持是初始的細菌刺激，而非轉基因整合，觸發了葉片愈傷組織的匍匐莖再生。為了評估匍匐莖樣組織的特征，我們分析了已知在常規匍匐莖中高表達的基因。在檢測的23個候選基因中，有9個在匍匐莖樣組織中的表達量比常規枝條高4倍以上，這表明匍匐莖樣組織與常規匍匐莖具有共同的分子特征。

雖然馬鈴薯塊莖化過程已被廣泛研究，但此前尚無研究鑒定出在塊莖發育之前特異性誘導匍匐莖形成的分子調控因子。因此，我們對經GV3101預處理的葉片愈傷組織進行了RNA測序，并分析了差異表達基因，以確定負責匍匐莖樣組織形成的分子因子。通過比較公開的組織特異性轉錄組數據，我們鑒定出GV3101調控的、在匍匐莖和/或塊莖中表達水平特異性高于其他組織的基因。其中，我們發現了兩個磷脂酰乙醇胺結合蛋白家族基因：StSP6A和StCENL1。PEBP家族基因，包括FLOWERING LOCUS T及類似蛋白，已知在多種植物物種的誘導開花中起關鍵作用。在馬鈴薯中，它們除了參與開花外，還是貯藏器官發育的關鍵調控因子。為了驗證我們的轉錄組分析結果，我們使用額外的生物學重復進行了RT-qPCR。由于重復間差異較大，僅在培養8周后上調表達的StSP6A顯示出統計學顯著性。StCENL1的表達在GV3101預處理組也有增加，但處于統計學顯著性的臨界值。與塊莖發育相關但未在我們的轉錄組數據中識別的其他基因，在GV3101預處理后未顯示顯著差異。同樣，對常規枝條器官發生相關基因的分析也未發現顯著差異。為了進一步研究PEBP基因在匍匐莖樣組織形成中的作用，我們構建了StSP6A和StCENL1的過表達株系，并使用了源自這些轉基因植物的葉片愈傷組織。在三個獨立的35S:StSP6A轉基因株系中，有兩個在沒有GV3101預處理的情況下，匍匐莖樣組織的形成效率有所提高。同樣，三個35S:StCENL1轉基因株系都顯示出顯著增強的匍匐莖樣組織形成能力。這些結果表明，PEBP家族基因的誘導表達與匍匐莖樣組織形成相關。為了驗證StCENL1和StSP6A在匍匐莖樣組織再生中的作用，將馬鈴薯葉片外植體接種攜帶針對各基因的RNA干擾載體的農桿菌菌株，隨后在匍匐莖誘導培養基上培養。我們觀察到，雖然StCENL1沉默效果不佳，但StSP6A沉默顯著降低了匍匐莖樣組織的再生頻率。通過RT-qPCR確認了RNAi構建體的基因沉默效率，StCENL1表達保持不變，而StSP6A轉錄本水平顯著降低。這些數據表明，觀察到的空載體與StCENL1 RNAi組之間類似的匍匐莖再生效率，可能歸因于StCENL1 RNAi構建體的沉默效率低。盡管StCENL1沉默的影響尚無定論，但我們的發現清楚地表明StSP6A是農桿菌誘導的匍匐莖樣組織形成所必需的。鑒于匍匐莖樣組織與常規匍匐莖的共享特征，以及貯藏器官調控因子StSP6A的參與，很明顯匍匐莖樣組織在功能上等同于真正的匍匐莖。

細菌的細胞成分可作為刺激物，誘導植物細胞的防御反應。因此，我們研究了這些分子模式是否也作為匍匐莖再生的誘導劑。我們制備了四種源自細菌細胞培養物的混合物：完整的GV3101細胞培養物、含細菌分泌分子的培養上清、消除細菌生物活性及熱不穩定分子（如蛋白質）的高壓滅菌培養物，以及破碎細菌細胞的超聲處理培養物。只有用完整GV3101細胞培養物處理的對照組，其匍匐莖再生效率有顯著提高。這些數據表明，預先形成的細菌分子模式不影響匍匐莖再生；相反，GV3101與葉片愈傷組織相互作用時的生物活性對此過程至關重要。工程化的農桿菌菌株擁有染色體DNA和Ti輔助質粒。為了研究這些基因組組件在匍匐莖再生中的作用，我們使用了缺少Ti輔助質粒但保留C58染色體的C58C1菌株，以及具有與GV3101不同染色體背景的LBA4404菌株。C58C1預處理具有與GV3101相似的效果，而LBA4404的效果則顯著較差。支持這些結果的是，在LBA4404預處理組中，PEBP家族基因的表達顯著低于GV3101處理組，而非PEBP基因StAGL11則無顯著差異。這些發現表明，農桿菌的C58染色體在激活馬鈴薯葉片愈傷組織的匍匐莖再生中起著關鍵作用。為了檢查參與農桿菌誘導匍匐莖再生的分子因子，我們對培養8周后的葉片愈傷組織進行了RNA測序，并分析了相對于0周的差異表達細菌基因。盡管有幾個細菌基因上調，但使用額外生物學重復進行的RT-qPCR驗證顯示變異性很高，在匍匐莖再生期間，排名靠前的基因均無統計學顯著性。基于這些結果，我們得出結論，細菌與葉片愈傷組織之間的初始相互作用激活了植物細胞內的分子信號傳導，而非持續的細菌基因表達直接驅動匍匐莖再生。為了進一步研究不同農桿菌菌株誘導匍匐莖再生能力的差異，我們進行了全基因組測序和比較單核苷酸多態性分析。由于GV3101和C58C1共享C58染色體背景，而LBA4404含有Ach5背景，因此在LBA4404中鑒定出大量SNP。為了縮小候選基因范圍，我們篩選了導致關鍵密碼子變化的SNP，特別是終止獲得、終止丟失和起始丟失替換。此篩選過程鑒定出209個終止獲得、42個終止丟失和71個起始丟失SNP。廣泛的基因組差異和大量關鍵SNP表明，LBA4404誘導能力的降低可能是多種遺傳變異協同作用的結果。我們接下來研究了農桿菌誘導的匍匐莖再生是否可以應用于不同的馬鈴薯品種。在測試的六個不同品種中，除Bintje外，其他品種都成功實現了匍匐莖再生和隨后的塊莖形成，表明該方法在大多數馬鈴薯品種中具有廣泛適用性。為了研究Bintje缺乏再生反應的原因，我們分析了在匍匐莖誘導培養基培養期間，經農桿菌共培養后StSP6A和StCENL1的表達。結果顯示，在Desiree中，這些基因的表達顯著增加，而在Bintje中，它們的表達在培養期間基本保持不變。這些發現證實了StSP6A和StCENL1的誘導與匍匐莖再生密切相關。接下來，我們研究了通過匍匐莖再生引入塊莖的轉基因在克隆繁殖過程中是否保持穩定。我們選擇了來自Victoria葉片愈傷組織匍匐莖再生產生的表達GUS的轉基因塊莖，并通過塊莖發芽進行了兩代克隆繁殖。在第一代和第二代中，所有塊莖都保留了GUS基因表達，表明通過匍匐莖再生產生的轉基因塊莖可以穩定繁殖。

既然已確定匍匐莖的從頭器官發生通過愈傷組織中間體進行，我們推斷愈傷組織階段可作為對抗病毒系統性傳播的生物過濾器。因為植物病毒通常利用成熟的連續維管組織進行移動，而從無維管系統的愈傷組織再生匍匐莖，為將器官發育與病毒轉運脫鉤提供了機會。此外，病毒感染是馬鈴薯產量限制的主要因素，因為受感染的植物產量顯著降低。因此，我們研究了是否可以從病毒感染葉片組織再生無病毒匍匐莖。為此，我們獲得了在韓國海南田栽培的商業化Atlantic塊莖，預計其自然感染了病毒。正如預期，從這些塊莖發芽的幾株植株表現出典型的花葉病毒癥狀。為了鑒定病毒基因組，我們進行了從頭轉錄組組裝。對組裝讀段的BLASTX分析揭示存在一種完整的病毒，即馬鈴薯Y病毒。從PVY感染葉片衍生的愈傷組織產生了再生匍匐莖。在分析的七個再生匍匐莖中，有四個顯示出PVY RNA水平的急劇降低，證明可以通過從受感染葉片愈傷組織再生匍匐莖直接獲得無病毒匍匐莖。總體而言，我們的研究結果表明，多能性葉片愈傷組織可以分化為匍匐莖等特化器官，并且葉片愈傷組織的器官發生潛力可以通過外部刺激得到擴展。這項技術為在馬鈴薯中生成無病毒貯藏器官提供了一個有前景的策略。

自植物組織培養起始以來，愈傷組織形成常被描述為脫分化過程，因為可以從多能性愈傷組織中誘導產生新的枝條或根器官發生。然而，最近的討論對將愈傷組織歸類為真正脫分化組織提出了爭議。如果愈傷組織形成嚴格是脫分化過程，那么源自不同器官類型的愈傷組織應表現出相似的性質。盡管如此，許多基因在空中組織來源和根來源的愈傷組織中顯示出不同的表達模式。支持這些發現的是，從愈傷組織再生的器官類型通常高度依賴于原始來源組織。在大麥中，根來源的愈傷組織主要再生根，而未成熟胚來源的愈傷組織則再生枝條。類似地，在擬南芥中，雌蕊來源的愈傷組織再生的是生殖器官，而非常規的營養枝條。這些觀察結果表明，愈傷組織保留了與其來源組織密切相關的特定性質。然而，我們的研究表明，通過外源刺激，可以從葉片來源的愈傷組織再生匍匐莖，而非從匍匐莖或塊莖再生。這一發現提供了證據，表明可再生器官類型的限制可以被克服，這暗示愈傷組織可能確實表現出類似脫分化的可塑性。類似于莖尖分生組織在階段轉變過程中響應發育信號形成不同器官類型，賦予目標器官特性的關鍵基因的異位表達可能會擴展器官類型范圍。除了PEBP家族基因，我們的轉錄組分析還揭示，在馬鈴薯中，作為貯藏蛋白參與塊莖發育和淀粉積累的patatin-like蛋白基因在培養8周時，在農桿菌處理的愈傷組織中上調。然而，越來越多的證據表明patatin-like基因是多功能的：它們被微生物刺激誘導，并有助于早期防御反應，同時也參與發育過程。這些發現引發了一種可能性，即patatin-like蛋白可能有助于器官發生的重編程。未來研究patatin-like基因的功能作用，對于充分理解匍匐莖形成的分子框架將很有價值。雖然我們觀察到農桿菌GV3101共培養顯著提高了匍匐莖再生效率，但含有二元載體pC1301的GV3101進一步提高了該效率。盡管目前對此尚無確鑿證據，我們提出兩種假設。首先，從二元載體切割下來的T-DNA本身可能作為外源DNA誘導植物細胞產生各種反應。據報道，細菌DNA會在植物中引起免疫反應，包括產生活性氧和沉積胼胝質。因此，轉入植物細胞的T-DNA可能誘導影響PEBP家族基因表達的免疫反應。其次，二元載體中的選擇標記可能有助于篩選活的細菌細胞。由于活菌可以提高匍匐莖再生效率，在給定OD₆₀₀濃度下，高比例的活菌細胞可能增強匍匐莖再生。細菌與植物之間的相互作用通常與植物防御反應的激活相關。植物細胞通過模式識別受體識別微生物相關分子模式，觸發免疫相關基因的表達。除了防御反應，微生物信號還能促進植物的組織再生和器官發生。在我們的研究中，用農桿菌GV3101預處理似乎激活了馬鈴薯葉片愈傷組織的防御反應。然而，農桿菌誘導匍匐莖再生的確切分子機制仍不清楚。基于我們的發現，即在葉片愈傷組織中未檢測到顯著上調的細菌基因，且只有C58染色體背景能有效誘導匍匐莖再生，細菌與植物細胞之間的初始相互作用可能影響了細菌染色體基因組，以產生目前尚未鑒定的分子因子。這些因子可能重編程植物染色質景觀，導致對匍匐莖再生至關重要的PEBP家族基因表達升高。總之，我們建立了一種從馬鈴薯葉片愈傷組織誘導匍匐莖再生的方法。我們的研究結果表明，PEBP家族基因的表達與此過程密切相關。值得注意的是，活體農桿菌的存在顯著增強了愈傷組織的匍匐莖再生。該方法適用于各種馬鈴薯品種，有望對生產轉基因和無病毒塊莖非常有用。本研究為從植物愈傷組織誘導多種器官提供了有價值的見解，并將有助于未來關于植物再生機制的研究。