《Plant Gene》：Activity of transgenically expressed maize defensive genes and proteins against the biotrophic maize pathogen
Ustilago maydis
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玉米抗病基因在生物真菌Ustilago maydis中的有效性研究。轉基因懸浮培養物中，chitinase A、defensin、E2F2-1、maizewin和metallothionein顯著抑制病原菌生長，而chalcone isomerase 3基因則促進生長。該研究揭示了部分抗壞死性病原的基因對生物性病原也存在交叉保護效應，為開發廣譜抗病玉米提供理論依據。
帕特里克·F·道德（Patrick F. Dowd）| 托德·A·諾伊曼（Todd A. Naumann）| 埃里克·T·約翰遜（Eric T. Johnson）
美國農業部（USDA），農業研究服務局（Agricultural Research Service），國家農業利用研究中心（National Center for Agricultural Utilization Research），作物生物保護研究組（Crop Bioprotection Research Unit），地址：美國伊利諾伊州皮奧里亞市大學街北1815號（1815 N. University St., Peoria, IL 61614, USA）
摘要
玉米是世界上最重要的糧食作物之一，但其產量受到多種疾病的限制，其中一些疾病會導致毒素在谷物中積累。一些研究已經鑒定并驗證了針對壞死性病原真菌的潛在玉米抗性基因，但針對生物性病原真菌的抗性基因尚未得到充分研究。先前有研究表明，能夠持續表達多種玉米基因的轉基因愈傷組織對昆蟲和壞死性鐮刀菌（Fusarium）具有抗性。在本研究中，評估了這種愈傷組織對生物性玉米病原菌——玉米黑穗菌（Ustilago maydis）的抗性。含有幾丁質酶A和幾丁質酶2、防御素、E2F2、香葉基香葉基轉移酶、水解酶、maizewin和金屬硫蛋白基因的愈傷組織顯著抑制了玉米黑穗菌的生長。而含有查爾酮異構酶3基因的愈傷組織則促進了玉米黑穗菌的生長，這可能與之前發現的茉莉酸防御途徑的誘導有關。此外，異源表達并純化的幾丁質酶A、玉米水解酶、maizewin和金屬硫蛋白在添加到凍干培養基平板上（濃度為1000 ppm或更低）時也能抑制玉米黑穗菌的生長。本研究表明，某些基因對生物性和壞死性玉米病原菌均具有抗性，但有時賦予對壞死性病原菌抗性的基因反而會增加對生物性病原菌的敏感性。這些信息將有助于開發出更抗病的玉米品種，從而為種植者、最終用戶和消費者帶來更可持續的生產效益。
引言
隨著人類人口的不斷增長，對食品生產的需求也在增加。玉米是全球主要的糧食作物之一（Erenstein等人，2022年）。玉米被用于人類食物、動物飼料和乙醇生產，這對其可持續生產提出了更高要求。玉米的生產受到多種疾病的限制（Savary等人，2019年），這些疾病會影響玉米幼苗、根系、莖稈、葉片和成熟籽粒（White，1999年）。某些真菌會侵襲玉米籽粒，并導致毒素在其內部積累（Payne，1999年）。
許多真菌疾病采用壞死性生活策略，通過殺死細胞后進行攝食。玉米的壞死性病原真菌包括某些鐮刀菌（Fusarium）菌株、灰葉斑病（Cercospora zeae-maydis）和南方玉米葉枯病（Cochliobolus heterostrophus）（Zhu等人，2021年）。而采用生物性生活策略的玉米真菌疾病包括煤斑病（Phyllachora maydis）（Valle-Torres等人，2020年）、霜霉病（Peronosclerospora）（Crouch等人，2022年）、銹病（Puccinia）和黑穗病（Ustilago maydis）（Zhu等人，2021年）。煤斑病長期以來一直是南美洲、中美洲部分地區及其周邊島嶼的主要病害，最近在美國和加拿大的中西部玉米種植區也成為了極具破壞性的病害（Rocco da Silva等人，2021年）。雖然實驗室可以很容易地生成用于評估對壞死性真菌抗性的繁殖體，但幾乎所有生物性真菌都無法通過這種方式獲得。盡管使用抗性雜交品種可以減少玉米黑穗菌造成的經濟損失（Pataky，1999年），但在某些情況下損失仍可能非常嚴重（Earecho和Gabrekiristos，2024年）。然而，玉米黑穗菌會經歷一個可培養的單倍體腐生酵母生長階段，這使其成為研究生物性真菌生物學的有用模型（Brefort等人，2009年）。這一特性也有助于確定哪些抗性分子可能對生物性真菌有效。
先前的研究利用轉基因玉米愈傷組織鑒定出幾種新的抗性基因，這些基因通常也具有抗蟲性（例如Dowd和Johnson，2018年；Dowd等人，2020年；Dowd等人，2023年）。這些研究還經常包括直接測試從酵母中純化的由相同抗性基因編碼的蛋白質，其抗真菌活性支持了愈傷組織實驗的結果（例如Dowd等人，2019a；Dowd等人，2020年；Dowd等人，2023年）。這些研究中研究的基因編碼了多種類型的蛋白質，包括水解酶、調節蛋白和復合蛋白。為了探究這些基因是否也能增強對代表性生物性病原菌——玉米黑穗菌的抗性，研究人員進行了類似針對鐮刀菌的研究。含有這些抗性基因及其相應異源蛋白的愈傷組織被用來檢測其對玉米黑穗菌的抗性，以確定哪些基因對這種生物性病原菌也有效，從而更好地理解抗性機制，并識別出在廣譜抗蟲性中最有價值的基因。與其他生物性真菌一樣，玉米黑穗菌也會產生干擾玉米防御反應的效應分子（Brefort等人，2009年）。因此，識別能夠持續產生并抵御這種真菌的基因具有額外價值。
真菌的來源與培養
真菌的來源與培養
從伊利諾伊州種植的玉米中分離出兩種玉米黑穗菌（Ustilago maydis）菌株，分別命名為NRRL YB255和YB380，這些菌株來自美國農業部農業研究服務局（USDA）位于伊利諾伊州皮奧里亞的NRRL培養收集中心（NRRL Culture Collection）。這些菌株在含有酵母提取物、麥芽提取物、蛋白胨和葡萄糖的瓊脂培養基（配方：3克酵母提取物、3克麥芽提取物、5克蛋白胨、10克葡萄糖、15克瓊脂，1升水中）上，于25°C條件下培養。將培養2天的菌落從培養皿上刮下后，用0.01%的Triton X-100稀釋。通過稀釋平板法來測定活菌數量。
轉基因愈傷組織的抗性檢測
大多數經過改造、含有先前鑒定出的抗真菌玉米基因的愈傷組織顯著抑制了兩種玉米黑穗菌菌株的生長，這一點從菌絲生長寬度與對照組的差異中可以看出（見表2）。具體而言，防御素（例如試驗2中GUS對照組為2.5 ± 0.2，N = 6；防御素處理組為0.3 ± 0.2，N = 6，P < 0.0001）、E2F2–1（例如試驗1中GUS對照組為4.4 ± 0.2，N = 6；E2F2–1處理組為2.3 ± 0.3，N = 6，P = 0.0010）以及金屬硫蛋白（例如試驗1中……）都表現出顯著的抗性效果。
討論
以往關于玉米黑穗菌的研究主要集中在感染和腫瘤形成過程上，但也有一些關于玉米防御反應的研究。多項研究使用不同的方法檢測了潛在的抗性基因。以下討論將這些例子按功能分類，盡管在某些情況下，生物活性蛋白可能具有多種功能。
結論
本研究表明，許多既能增強對毛蟲抗性又能抵抗壞死性真菌（如鐮刀菌）的玉米防御基因，同樣也有助于提高對代表性生物性病原菌——玉米黑穗菌的抗性。然而，有一個例外情況表明，某些抗性基因可能會間接降低抑制生物性真菌的抗性因子。這些信息將有助于更快地開發出更有效的抗病玉米品種，從而惠及種植者、最終用戶和消費者。
作者貢獻聲明
帕特里克·F·道德（Patrick F. Dowd）：負責撰寫、審稿和編輯，撰寫初稿，方法學設計，實驗實施，數據分析，概念構建。
托德·A·諾伊曼（Todd A. Naumann）：負責撰寫、審稿和編輯，方法學設計，實驗實施。
埃里克·T·約翰遜（Eric T. Johnson）：負責撰寫、審稿和編輯，方法學設計，實驗實施。
免責聲明
手稿中提到的公司名稱或產品并不表示美國農業部（USDA）對其優于未提及的其他公司的類似產品進行推薦或認可。美國農業部是一個平等機會的雇主。
資金來源
本工作得到了美國農業部（U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service）的支持。本研究未接受來自公共部門、商業機構或非營利組織的任何特定資助。
致謝
我們感謝E. Grotewald提供初始的BMS細胞培養物，美國農業部農業研究服務局NRRL培養收集中心提供玉米黑穗菌菌株，M. Doehring、D. Lee和K. Sollenberger提供技術支持，以及E. J. Muturi、M. M. Vaughan和T. J. Ward對手稿初稿的修改意見。
