《Polymer》：Effect of source and reaction conditions on the structure and rheological properties of gelatin methacryloyl
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GelMA的合成方法與明膠來源對結構及流變學性質的影響研究，系統比較了豬、牛、魚三種明膠經雙相與單相法（DMSO溶劑）合成的甲丙烯酰化程度、二級結構及熱響應凝膠行為，發現單相法能更精確調控取代度但可能干擾鏈間作用，優化后GelMA適用于3D生物打印和組織工程。
Laura Di Muzio | Flavia Borrelli | Claudia Pigliacelli | Simone Manetto | Alessia Ciogli | Giulia Mazzoccanti | Mattia Spano | Barbara Bigi | Maria Antonietta Casadei | Stefania Petralito | Patrizia Paolicelli
羅馬智慧大學藥物化學與技術系，意大利羅馬 00185
摘要
本研究的目的是系統地探討明膠的來源和合成方法如何影響甲基丙烯�；髂z（GelMA）的結構和流變性能。盡管GelMA在生物醫學研究中得到廣泛應用，但關于明膠來源和合成方法對GelMA影響的直接和比較分析仍然有限，尤其是在傳統雙相合成方法與新型單相合成方法之間的差異方面。為填補這一空白，本研究使用豬明膠、牛明膠和魚明膠，分別采用傳統的雙相合成方法和在極性非質子溶劑DMSO中進行的均相合成方法制備了GelMA。對所得聚合物進行了廣泛的表征，包括衍生化程度（DD）、二級結構以及熱響應性凝膠化行為等方面的研究。研究結果表明，明膠的來源和合成方法對GelMA的性能具有顯著影響。雖然單相合成方法能夠更好地控制衍生化程度，但同時也改變了聚合物的流變行為，這可能是由于鏈間相互作用受到破壞所致。通過闡明這些關系，本研究為選擇合適的明膠來源并根據最終生物材料的性能要求定制合成策略提供了理論依據�？傮w而言，這些發現有助于優化GelMA在多種制藥和生物醫學應用中的性能，包括3D生物打印和組織工程。
引言
明膠（Gel）是組織工程和再生醫學中最常用的生物聚合物之一，尤其是其甲基丙烯�；苌铮℅elMA）[[1], [2], [3]]。通過將明膠與甲基丙烯酰基團進行功能化，可以克服傳統明膠基支架的不足，如機械性能較差、在生理溫度下結構不穩定以及在組織培養過程中容易快速溶解等問題。2000年，Van Den Bulcke等人首次報道了利用甲基丙烯酸酐（MAA）合成GelMA的方法[[4]]。值得注意的是，盡管經過二十多年的研究，GelMA的基本合成方法幾乎沒有變化，文獻中僅報道了少量的反應條件調整[[5]]。通常，首先將明膠溶解在水性緩沖液中（最常用的是磷酸鹽或碳酸鹽緩沖液），以創造可控的反應環境，然后加入甲基丙烯酸酐作為功能化試劑。為了促進反應，混合物通常需要在高于聚合物凝膠化溫度（Tgel）的溫度下加熱。雖然這種合成方法被廣泛采用并且可以實現明膠的功能化，但它對衍生化程度和GelMA的物理化學性質的控制能力有限[[6]]。這種缺乏可調性的問題對于某些應用來說是一個重大限制，因為在這些應用中需要精確且可重復地控制材料性能，例如增材制造和組織工程的支架制備以及三維細胞培養[[5],[7],[8],[9],[10]]。這種限制主要源于甲基丙烯酸酐的水溶性較差，迫使反應在雙相體系中進行（即兩相合成），其中明膠位于水相，而甲基丙烯酸酐形成獨立的有機相，從而影響了聚合物反應基團的可用性。為了克服這一限制，Di Muzio等人最近提出了一種單相合成方案[[11]]，在該方案中，明膠和甲基丙烯酸酐均完全溶解在有機溶劑二甲基亞砜（DMSO）中，消除了合成過程中的相異性。這種方法能夠更好地控制明膠的衍生化程度，同時減少了傳統雙相合成所需的甲基丙烯酸酐用量。除了對反應效率的影響外，DMSO的使用還顯著改變了GelMA的物理化學性質，尤其是其流變響應。典型的熱溶-凝膠轉變過程發生了顯著變化，凝膠化溫度（Tgel）發生了明顯變化，使得材料在室溫下仍能保持低粘度液態，從而便于操作。這一特性在那些需要GelMA在室溫下具有類似固體行為或高粘度的應用中特別有利，例如高分辨率生物打印技術（如立體光刻（SLA）和數字光處理（DLP）生物打印[[12],[13],[14],[15]]。
盡管取得了顯著進展，但不同來源的GelMA以及采用不同合成方法（雙相 vs. 單相）制備的GelMA之間的系統比較仍然有限。迄今為止的大多數比較研究僅集中在傳統雙相方法的變體上。為填補這一空白，本研究系統地探討了明膠來源和合成策略（雙相 vs. 單相）對GelMA性能的綜合影響。具體而言，本研究首次直接比較了使用傳統雙相方法和新型單相方法從豬明膠、牛明膠及冷水魚明膠制備的GelMA衍生物。評估了明膠來源和合成方法對GelMA流變性能和機械性能的影響，并將其與氨基酸組成和二級結構的差異進行了關聯。通過系統地比較這些變量，本研究旨在為GelMA的合成提供理論指導，從而精細調整聚合物性能，以滿足特定的生物醫學和制藥應用要求。
材料
材料
所有使用的試劑均為分析級。豬皮來源的A型明膠（P-Gel，約300 Bloom單位）、牛皮來源的B型明膠（B-Gel，約225 Bloom單位）以及冷水魚皮來源的魚明膠（F-Gel）、無水二甲基亞砜（DMSO）、氘代水（D2O）、甲基丙烯酸酐（MAA）、2-羥基乙基甲基丙烯酸酯（HEMA）、煙酰胺（Nic）、過硫酸銨（APS）、N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）和截留分子量為12-14 kDa的透析膜均購自Sigma公司。
反應條件對GelMA衍生化程度的影響
首先分析了來自不同來源的明膠（豬皮來源的P-Gel、牛皮來源的B-Gel和魚皮來源的F-Gel）的氨基酸組成。經過dabsyl衍生化處理后，所有明膠樣品中均檢測到了18種氨基酸（見圖S1和表S1）。各來源的相對氨基酸組成如圖1所示。
值得注意的是，His和Lys在色譜圖中呈現多個峰，這是因為它們能夠與dabsyl發生多次衍生化反應。
結論
用于明膠甲基丙烯酰化的反應條件顯著影響了甲基丙烯�；潭鹊闹噩F性和GelMA的流變性能。在DMSO中的均相合成方法能夠更好地控制甲基丙烯酰化程度，并有助于獲得具有更高取代水平的生物相容性衍生物。此外，這種方法還減少了甲基丙烯酸酐的消耗并提高了聚合物的合成效率。
CRediT作者貢獻聲明
Laura Di Muzio：撰寫 – 審稿與編輯、數據可視化、方法學設計、實驗研究、數據分析、概念構建。
Flavia Borrelli：實驗研究。
Claudia Pigliacelli：撰寫 – 審稿與編輯、初稿撰寫、方法學設計、實驗研究、數據分析。
Simone Manetto：撰寫 – 審稿與編輯、方法學設計、實驗研究、數據分析。
Alessia Ciogli：撰寫 – 審稿與編輯、初稿撰寫、方法學設計。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的財務利益沖突或個人關系可能影響本文的研究結果。
