藥用植物和傳統醫學在管理和預防多種慢性疾病中扮演著重要角色，全球約有5萬至7萬種植物被記錄具有藥用價值。世界衛生組織（WHO）強調傳統醫學的重要性，并支持成員國將其與現代醫療系統整合。澳大利亞原住民已在澳大利亞大陸生活了至少6.5萬年，他們與當地的動植物有著深厚的聯系，并利用其作為藥物、食物、衣物、住所、工具和武器。他們的民族醫藥知識仍然充滿活力，在澳大利亞已記錄了約1511種藥用植物。其中，昆士蘭州的原住民社區使用了135種藥用植物來治療62種疾病和病癥，包括傷口和創傷引起的疼痛和炎癥。

Iningai社區是昆士蘭中西部最大的原住民族群之一，位于沙漠高地生物區，其豐富的原住民生物文化知識在科學研究方面較少涉及，是發現潛在新藥知識的有希望來源。最近的研究表明，生長在干旱地區、暴露于不同環境脅迫下的植物，仍然是潛在新型生物活性化合物的未開發資源。將原住民生物文化知識與現代科學相結合的合作方法已被證明是有前途的生物發現策略之一。因此，用于治療炎癥和相關疾病的Iningai藥用植物可能為開發天然抗氧化補充劑或抗炎藥物提供新途徑。

本研究旨在：（i）評估Iningai原住民社區使用的選定藥用植物的植物化學組成；（ii）評估選定植物粗提物的抗氧化和抗炎特性；（iii）通過合作研究支持對原住民生物文化知識的驗證和保護，同時識別有前景的植物物種和提取物，以用于后續先導化合物的分離和循證草藥或治療產品的開發。

獲得了Iningai原住民社區對藥用植物研究的倫理和文化許可。使用人外周血單個核細胞（PBMC）的體外實驗在詹姆斯·庫克大學人類研究倫理委員會的倫理批準號H8523下進行。

本研究使用的所有化學品和試劑均為分析純級別。

使用微孔板讀數器測定總酚含量（TPC）和抗氧化活性。使用流式細胞儀測定細胞活力和抗炎活性的影響。

本研究中評估的所有植物物種均由第一作者和Iningai傳統監護人于2022年6月從澳大利亞昆士蘭中部的Iningai地區采集。植物分類學鑒定由昆士蘭植物標本館的植物學家確認。為每個植物物種分配了標本館編號，憑證標本存放于澳大利亞熱帶植物標本館。新鮮葉片用流動自來水沖洗，并在烘箱中干燥一周。

將每種植物物種的10克干葉研磨成粗粉，轉移至干凈的燒瓶中，加入50毫升甲醇。混合物不斷攪拌20分鐘以獲得最佳提取物。每20分鐘添加新鮮溶劑，總提取時間為1小時。將三個循環的提取物合并，并使用過濾系統過濾，濾液溶劑使用旋轉蒸發儀濃縮至16毫升。

將16毫升濃縮提取物分成8管，每管體積2毫升，用于測試七大類植物化學成分的存在與否。定性植物化學分析如下進行：生物堿測試、類固醇測試、萜類測試、單寧測試、皂苷測試、蒽醌苷測試和強心苷測試。

在評估樣品總酚含量之前，首先測定了最大吸收波長和最佳反應時間。使用Folin-Ciocalteu（F–C）法測定了八種藥用植物葉片粗提物中的總酚含量。在獲得最大吸收波長和最佳反應時間后，使用F–C法測定了總酚含量。總酚含量以毫克沒食子酸當量每克干提取物表示。

通過測量其在特定波長下的吸光度，評估了八種藥用植物葉片粗提物清除DPPH自由基的能力。制備了0.1 mM的DPPH溶液，并將每種濃度的DPPH溶液轉移至96孔板中進行掃描，以確定最大吸收波長和標準品濃度與吸光度之間的關系。

制備了八種藥用植物葉片粗提物和標準化合物的1毫克/毫升儲備溶液。然后，在甲醇中進行兩倍系列稀釋制備工作溶液。隨后，將每個樣品/標準化合物與0.1 mM的DPPH溶液在96孔板中混合。對照樣品通過將甲醇與DPPH以相同比例混合制備。然后將反應混合物在室溫下避光孵育1小時。孵育1小時后，在先前確定的最大吸收波長下測量吸光度。最后，計算反應混合物中DPPH自由基被清除的百分比，并通過在GraphPad Prism中繪制清除百分比對樣品濃度的曲線，通過插值法從標準曲線確定IC₅₀值。

從健康供體的血沉棕黃層中分離PBMCs，并使用密度梯度法進行分離。然后將PBMCs在液氮氣相中冷凍保存。實驗當天，將PBMCs在37°C水浴中解凍，并使用預熱無菌培養基洗滌。隨后，將細胞密度調整至每孔約1 × 10⁶個細胞，并接種在96孔U底板中。然后，用細菌來源的脂多糖（LPS）激活PBMCs，并在37°C、5% CO₂培養箱中孵育2小時。2小時后，用八種藥用植物的甲醇葉片粗提物處理LPS激活的PBMCs。地塞米松和含有DMSO的培養基分別用作陽性和陰性對照。最后，將培養板在37°C、5% CO₂培養箱中孵育過夜。第二天，離心培養板，收集上清液用于細胞因子分析。細胞用于細胞活力測定。

在定量PBMC培養上清液中的促炎細胞因子之前，分析PBMCs的細胞健康/活力。收集上清液后，洗滌PBMCs，然后用活/死活力染料染色。染色細胞在冰上避光保持30分鐘。30分鐘后，洗滌染色細胞。最后，將細胞重懸于PBS緩沖液中，并通過流式細胞儀運行，以區分活細胞和死細胞。在分析之前，應用前向散射門控以排除雙聯體細胞。在了解粗提物對細胞活力的影響后，進一步分析無毒性粗提物的上清液中的促炎細胞因子/趨化因子譜。

使用定制LEGENDplex多分析物流式檢測試劑盒定量PBMC培養上清液中的促炎細胞因子/趨化因子。該檢測是基于微球的，能夠使用流式細胞儀同時分析13種促炎細胞因子/趨化因子。從流式細胞儀獲得的數據使用軟件進行進一步分析。最后，用八種粗提物處理的培養上清液中每種細胞因子的數量以皮克/毫升表示。

所有數據均以平均值±標準差表示。使用GraphPad Prism進行統計分析，通過非配對t檢驗比較樣本平均值與對照的平均值。

最近，研究人員記錄了Iningai灌木醫學知識，并從Iningai地區的Barcaldine地區鑒定出45種藥用植物。雖然有些植物在昆士蘭其他地區很常見，并且以其強大的抗氧化和抗炎活性而聞名，但研究發現超過14種獨特的藥用植物用于治療腸道疾病和炎癥。這些植物從未從西方科學的角度進行過研究，這為本項目增添了新穎性。基于實地結果，并與Iningai社區和熱帶土著民族植物學中心協商，研究人員收集了八種Iningai藥用植物，并使用各種方法評估了它們的植物藥學特性。

植物通常產生多種類別的植物化學物質，其中大多數具有有趣的生物活性。植物生物活性的多樣性和強度可能與其所含化學物質的多樣性和數量有關。因此，研究人員評估了八種藥用植物葉片粗提物中六類主要植物化學成分的存在。

在測試的八種藥用植物中，D. tenuifolia對所有六類主要植物化學成分檢測均呈陽性。在以下物種中檢測到四類：TB75、TB79、P. pubescens和S. lanceolatum。V. macrocalyx顯示的陽性結果最少，僅微弱存在類黃酮、類固醇和皂苷。S. lanceolatum和G. australe的粗提物顯示出強烈的類固醇存在。只有TB75、G. australe和D. tenuifolia對苷類檢測呈陽性。除G. australe和V. macrocalyx外，所有藥用植物的粗提物對生物堿檢測均呈陽性，其中TB79呈強陽性結果。

F–C法是廣泛用于定量食品中總（多）酚含量的測定方法。F–C試劑是磷鉬酸和磷鎢酸的復雜混合物，被酚類化合物還原，形成最大吸收波長在765納米左右的藍色復合物。然而，最大吸收波長可能會因F–C試劑對化合物/底物的響應方式而異，因為多酚具有不同的化學結構。因此，將八種藥用植物葉片粗提物與標準化合物沒食子酸進行比較，以確定最大吸收波長。所有八種葉片粗提物顯示出相似的吸收光譜。最大吸收波長在700至800納米之間。此外，在740至770納米波長范圍內，吸光度值的變化不顯著。因此，為了測定總酚含量，選擇了760納米的波長。在選擇了最大吸收波長后，確定了粗提物在選定波長下與F–C試劑顯色所需的最佳時間。反應動力學顯示，所有樣品從10到40分鐘吸光度增加，然后變得穩定或逐漸下降。對于所有樣品，包括沒食子酸，最佳響應在30到40分鐘之間觀察到，表明在測量吸光度之前需要至少30分鐘的孵育時間。因此，使用760納米的最大吸收波長和30分鐘的最佳反應時間來測定八種藥用植物葉片粗提物中的總酚含量。

為了定量粗提物中的總酚含量，使用參考化合物沒食子酸繪制了校準曲線。獲得的R²值近似完美的線性。在兩種不同濃度下測量了總酚含量。結果以毫克沒食子酸當量/克干粗提物表示。在低濃度和高濃度下，S. lanceolatum的總酚含量最高，其次是P. pubescens。TB75、G. australe和P. angustifolium在1000微克/毫升濃度下的總酚含量幾乎相當。然而，在較低濃度下，P. angustifolium的含量較高，其次是TB75。TB79在兩種濃度下的總酚含量最低。

DPPH是廣泛用于評估植物不同部位粗提物抗氧化特性的自由基。植物提取物清除DPPH自由基的能力主要通過分光光度法測量特定波長下的吸光度來確定。因此，首先需要確定最大吸收波長和儀器對不同DPPH濃度的響應。最大吸收波長為517納米。DPPH自由基濃度與其在517納米處的吸光度之間也存在線性關系。

在本研究中，通過測量其在517納米處的吸光度，評估了八種藥用植物葉片粗提物在50至400微克/毫升不同濃度下的抗氧化活性。沒食子酸用作參考化合物。所有粗提物的DPPH自由基清除效果隨其濃度增加而增加。在400微克/毫升濃度下，八種藥用植物葉片粗提物的DPPH自由基清除活性排序如下：V. microcalyx > TB75 > P. angustifolium > S. lanceolatum > P. pubescens > TB79 > D. tenuifolia > G. australe。參考化合物沒食子酸在400微克/毫升初始DPPH濃度下僅顯示76.60 ± 1.18%的清除率。與除V. macrocalyx外的所有粗提物樣品不同，沒食子酸在整個濃度范圍內表現出高且一致的清除活性。

本研究還測定了清除50%初始DPPH自由基濃度的抑制濃度值。物質的抗氧化能力與其IC₅₀值成反比。這意味著IC₅₀值較低的物質具有更好的抗氧化活性。在八種藥用植物物種的粗提物中，V. macrocalyx的IC₅₀值最低，為37.37 ± 1.01微克/毫升，其次是P. angustifolium、TB75和S. lanceolatum。D. tenuifolia的IC₅₀值最高，為206.50 ± 2.44微克/毫升。

抗氧化活性歸因于酚類和類黃酮含量。研究人員使用GraphPad Prism計算了總酚含量與DPPH自由基清除活性之間的Pearson相關系數。八種藥用植物葉片粗提物的總酚含量與抗氧化活性之間存在顯著相關性。

在測試的八種藥用植物中，P. angustifolium的葉片粗提物影響PBMCs的活力，而其余七種樣品則沒有。因此，進一步分析這七種物種的培養上清液以定量促炎細胞因子。

研究人員使用LEGENDplex流式檢測法研究了七種物種葉片粗提物對LPS刺激的PBMCs上清液中13種促炎細胞因子和趨化因子的抑制效果。在測試的13種促炎細胞因子和趨化因子中，七種植物物種的葉片粗提物顯著減少了IFN-γ、TNF、MCP-1和IL-23的產生。除D. tenuifolia的粗提物外，其余植物物種至少顯著抑制了四種促炎細胞因子。地塞米松用作陽性對照藥物。基于對四種細胞因子的顯著抑制，七種測試藥用植物的整體抗炎效果排序如下：TB75 > G. australe > V. microcalyx > S. lanceolatum > TB79 > P. pubescens > D. tenuifolium。TB75、G. australe和V. microcalyx的葉片粗提物是活性最強的三種，其次是S. lanceolatum和TB79。D. tenuifolium是所有七種測試物種中活性最弱的。

澳大利亞原住民使用的許多藥用植物以及其他本地植物和草藥已顯示出抗氧化和抗炎潛力。藥用植物的抗氧化潛力主要歸因于多酚，包括酚酸、類黃酮、芪類和木脂素。這些抗氧化化合物能夠防止或最大限度地減少活細胞中自由基的產生，因為過量的自由基是有毒的，并對重要的生物分子造成損害。如果身體的抗氧化防御系統無法控制自由基的產生，則可能導致氧化應激，從而逐漸導致炎癥和多種疾病。在這種情況下，需要補充抗氧化劑來支持身體的防御機制。近年來，人們對天然抗氧化劑的興趣超過了合成抗氧化劑，因為后者可能存在副作用。

因此，在本研究中，研究人員評估了昆士蘭中部Iningai原住民用于治療疼痛、炎癥以及與氧化應激相關疾病（如關節炎）的藥用植物物種的抗氧化和抗炎特性。最初研究了八種藥用植物物種的甲醇葉片粗提物的主要植物化學類別和總酚含量。除G. australe和V. microcalyx外，提取物對類黃酮和生物堿檢測呈陽性。此類測試結果可能因所用提取溶劑的極性而異，因為不同溶劑對次級代謝產物具有不同的親和力。例如，建議使用乙醚提取生物堿，氯仿提取類黃酮和萜類，而醇類主要用于提取極性次級代謝產物。無論使用何種提取溶劑，對主要植物化學類別的定性篩選表明，八種藥用植物物種的粗提物含有多種生物活性成分，這可能是其抗氧化和抗炎活性的原因。