《Postharvest Biology and Technology》：Identification of AcbHLH82 involved in internal browning of pineapple fruit by reducing ROS accumulation via activation of ROS scavenging genes
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本研究發(fā)現(xiàn)低溫儲存通過激活轉(zhuǎn)錄因子AcbHLH82及其下游抗氧化基因（AcAPX1、AcPOD1、AcPOD30），降低活性氧（ROS）積累，從而緩解龍眼內(nèi)部褐變，為保鮮策略提供理論依據(jù)。
楊明哲|譚雅涵|譚英英|魏偉|洪克謙|陳建業(yè)
中國華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，教育部南方園藝產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心，廣東省果樹蔬菜采后科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510642
摘要
為了闡明轉(zhuǎn)錄因子（TFs）在低溫緩解菠蘿內(nèi)部褐變（IB）過程中調(diào)節(jié)活性氧（ROS）代謝的分子機(jī)制，研究了在10°C（低溫）和25°C下儲存的‘Comte de Paris’菠蘿果實(shí)中ROS積累的變化以及TF介導(dǎo)的ROS清除基因的調(diào)控，重點(diǎn)關(guān)注基本螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）轉(zhuǎn)錄因子。在10°C下儲存的果實(shí)中，丙二醛（MDA）、過氧化氫（H?O?）和超氧陰離子（O?•–）的水平以及IB程度均低于25°C下儲存的果實(shí)。基于加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）和轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的K-means聚類，發(fā)現(xiàn)低溫誘導(dǎo)的AcbHLH82是一種與IB發(fā)展過程中ROS積累呈負(fù)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。電泳遷移率改變實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶報(bào)告基因分析表明，AcbHLH82通過特異性識別E-box順式元件（CANNTG）直接激活了AcAPX1、AcPOD1和AcPOD30等ROS清除基因的轉(zhuǎn)錄，從而增強(qiáng)了ROS清除能力。在菠蘿果肉中短暫過表達(dá)或沉默AcbHLH82后，發(fā)現(xiàn)AcbHLH82表達(dá)升高能有效減少IB，同時(shí)ROS清除基因的表達(dá)增加，H?O?和O?•–的水平也降低。這些結(jié)果揭示了低溫儲存通過AcbHLH82依賴的ROS清除基因激活增強(qiáng)抗氧化清除能力來緩解IB的分子基礎(chǔ)。
引言
菠蘿（Ananas comosus L.）是一種具有獨(dú)特風(fēng)味和營養(yǎng)價(jià)值的重要熱帶和亞熱帶水果，在經(jīng)濟(jì)和工業(yè)上具有重要意義。然而，在采后儲存過程中，它容易發(fā)生內(nèi)部褐變（IB）這一生理障礙，這會顯著影響果實(shí)的質(zhì)量和食用性（Ali等人，2020年；Zhang等人，2016年；Hou等人，2022年）。活性氧（ROS）、多酚氧化酶（PPO）和酚類底物被認(rèn)為是導(dǎo)致IB的主要因素。雖然PPO和酚類底物驅(qū)動(dòng)的IB的分子機(jī)制已得到廣泛研究（Li等人，2023年；Lai等人，2024年），但ROS驅(qū)動(dòng)的IB的分子基礎(chǔ)仍不夠清楚。
ROS在植物生長、發(fā)育以及對生物和非生物脅迫的響應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。線粒體作為ROS生成的主要場所，對于維持細(xì)胞氧化還原平衡至關(guān)重要（Blokhina和Fagerstedt，2010年；Sachdev等人，2021年；Sood，2025年）。然而，過量的ROS會產(chǎn)生有毒分子如過氧化氫（H?O?）和超氧陰離子（O?•–），導(dǎo)致線粒體蛋白質(zhì)氧化損傷。這種損傷會破壞線粒體結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)一步加劇氧化還原失衡和ROS積累，最終加速衰老（Hasanuzzaman等人，2020年；Meitha等人，2020年；Huang等人，2021年）。果實(shí)衰老是一個(gè)氧化過程，伴隨著ROS的顯著增加，尤其是O?•–和H?O?（Tian等人，2013年），這會加速細(xì)胞老化，降低儲存潛力，并損害果實(shí)品質(zhì)，這一現(xiàn)象在油桃（Wang等人，2015年）、龍眼（Lin等人，2021年）和獼猴桃（Eh等人，2024年）中也有報(bào)道。
轉(zhuǎn)錄因子（TFs）是植物在非生物脅迫下生長和發(fā)育的核心調(diào)節(jié)因子，通過激活多種途徑在不同水平上調(diào)節(jié)和減輕脅迫引起的損傷（Carretero-Paulet等人，2010年）。基本螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）家族是植物中最重要的轉(zhuǎn)錄因子群體之一（Pires和Dolan，2010年），參與多種生物過程，包括生長、發(fā)育以及對寒冷（Zhao等人，2018年）、干旱和鹽堿（Ji等人，2016年）等環(huán)境脅迫的響應(yīng)。越來越多的證據(jù)表明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)ROS清除基因（如過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、超氧化物歧化酶（SOD）等ROS解毒成分的基因來參與抗氧化防御。例如，在小麥中過表達(dá)TabHLH1可以增加POD、SOD和過氧化氫酶（CAT）的活性，從而減少ROS積累（Yang等人，2016年）。在煙草中，過表達(dá)MdbHLH130可以通過增強(qiáng)ROS清除酶的活性來降低干旱脅迫下的ROS水平（Zhao等人，2020年）。在擬南芥中，過表達(dá)CabHLH035可以通過增加SOD、POD和APX的活性來提高耐寒性（Zhang等人，2024年）。最近，So等人（2025年）和Li等人（2025年）報(bào)告稱，在百合中過表達(dá)LpbHLH144以及在Populus davidiana中過表達(dá)PdbUNE12可以通過增加關(guān)鍵抗氧化酶的活性來提高耐鹽性。重要的是，大量證據(jù)表明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子通過直接結(jié)合G/E-box元件來激活下游靶基因。在三葉橙（Poncirus trifoliata中，PtrbHLH直接結(jié)合POD啟動(dòng)子中的E-box元件來激活其表達(dá)，從而增強(qiáng)抗氧化能力和耐寒性（Huang等人，2013年）。在花生（Arachis hypogaea中，AhbHLH121通過直接結(jié)合其啟動(dòng)子中的G/E-box元件來激活AhPOD、AhCAT和AhSOD，從而提高耐鹽性（Zhao等人，2024年）。在鹽脅迫下的楊樹中，PagbHLH35通過結(jié)合PagPOD和PagSOD啟動(dòng)子中的G/E-box元件來增加POD和SOD的活性（Wang等人，2024年）。總體而言，這些研究表明bHLH轉(zhuǎn)錄因子通過直接調(diào)節(jié)抗氧化酶基因來增強(qiáng)植物的抗逆性。
低溫（≤10°C）（LT）可以維持氧化還原平衡，延緩ROS積累（Nadarajah，2020年），并抑制H?O?和O?•–的增加，從而延緩菠蘿的IB發(fā)生（Zhang等人，2015年）。因此，維持ROS的穩(wěn)態(tài)對于延長菠蘿果實(shí)的采后儲存壽命至關(guān)重要。然而，低溫緩解IB過程中調(diào)控ROS穩(wěn)態(tài)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍大部分未被探索。在本研究中，應(yīng)用加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）對包括丙二醛（MDA）、H?O?和O?•–含量在內(nèi)的表型指標(biāo)以及與LT緩解IB相關(guān)的差異表達(dá)基因（DEGs）進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)AcbHLH82是一種負(fù)調(diào)控ROS積累的轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)它還調(diào)控三種ROS清除基因AcAPX1、AcPOD1和AcPOD30。通過電泳遷移率改變實(shí)驗(yàn)（EMSA）和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)（DLR）評估了AcbHLH82對AcAPX1、AcPOD1和AcPOD30的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。此外，短暫過表達(dá)和沉默實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了AcbHLH82在調(diào)節(jié)菠蘿果實(shí)IB發(fā)展相關(guān)ROS代謝中的作用。本研究加深了對AcbHLH82在菠蘿儲存過程中介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的理解，并為開發(fā)保持易褐變果實(shí)品質(zhì)的采后保存策略提供了分子依據(jù)。
實(shí)驗(yàn)材料和處理
2024年12月，從中國湛江的一個(gè)果園獲取了處于商業(yè)成熟度70%（開花后18周）的‘Comte de Paris’菠蘿果實(shí)。所有果實(shí)均在收獲后2小時(shí)內(nèi)運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。選擇了無機(jī)械損傷、大小均勻、每果重約1.6公斤且無可見病害的果實(shí)。大約400個(gè)菠蘿果實(shí)被隨機(jī)分為兩組，每組200個(gè)。
IB發(fā)展、ROS積累和線粒體結(jié)構(gòu)變化的分析
如圖1A所示，在儲存期間，LT組和RT組之間的IB有明顯差異。LT組的果實(shí)在整個(gè)11天的儲存期間幾乎沒有可見的IB，而RT組的果實(shí)從第5天開始出現(xiàn)輕微褐變，并隨著儲存時(shí)間的延長而逐漸加劇。繼續(xù)儲存后，RT組的IB指數(shù)在第5天后急劇增加，在第11天達(dá)到2，而LT組則從第9天開始明顯增加。
討論
IB是菠蘿果實(shí)中的一個(gè)主要生理障礙，嚴(yán)重限制了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展并造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失（Zhang等人，2015年；Zhang等人，2016年；Hou等人，2022年）。在我們之前的研究中，低溫（10°C）儲存可以延緩菠蘿果實(shí)的IB發(fā)展（Hong等人，2023年）。為了闡明在這種條件下的IB耐受性的分子基礎(chǔ)，本研究進(jìn)行了生理、細(xì)胞和分子分析。
結(jié)論
本研究探討了在10°C下儲存‘Comte de Paris’菠蘿過程中與IB發(fā)展相關(guān)的ROS代謝的分子機(jī)制。在該溫度下儲存可以保持線粒體完整性，并降低H?O?、O?•–和IB的嚴(yán)重程度。基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的WGCNA和K-means聚類分析，發(fā)現(xiàn)bHLH轉(zhuǎn)錄因子AcbHLH82是IB耐受性的正向調(diào)節(jié)因子。AcbHLH82通過激活AcAPX1的轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮作用。
作者聲明
洪克謙和陳建業(yè)設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)；楊明哲完成了大部分實(shí)驗(yàn)并分析了數(shù)據(jù)；譚雅涵、譚英英和魏偉參與了一些實(shí)驗(yàn)；楊明哲、洪克謙和陳建業(yè)撰寫了手稿；洪克謙和陳建業(yè)提供了建議并修訂了手稿。所有作者都閱讀并批準(zhǔn)了最終版本的手稿。
CRediT作者貢獻(xiàn)聲明
譚雅涵：實(shí)驗(yàn)研究。譚英英：數(shù)據(jù)整理。楊明哲：初稿撰寫和數(shù)據(jù)整理。陳建業(yè)：審稿和編輯，監(jiān)督。魏偉：正式分析。洪克謙：初稿撰寫。致謝
本研究得到了國家自然科學(xué)基金（資助編號：32460790）和廣東省基礎(chǔ)與應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金（資助編號：2025A1515012724）的支持。
