《Poultry Science》：Circadian rhythm of melatonin receptors under monochromatic light and their regulatory effect on clock genes in the chick liver
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為明確不同波長光照如何通過影響褪黑素膜/核受體（Mel1a/b/c, RORα）的晝夜節(jié)律，進而調(diào)控肝臟時鐘基因表達，研究人員系統(tǒng)探討了單色光對雛雞肝褪黑素受體節(jié)律的影響及其對7個核心時鐘基因（cClock, cBmal1/2, cCry1/2, cPer2/3）的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)綠光可增強膜受體節(jié)律，紅光則削弱之；松果體切除術(shù)可減弱光波長的效應(yīng)。體外實驗證實，激活不同褪黑素受體可誘導(dǎo)時鐘基因表達，褪黑素可引導(dǎo)肝細胞時鐘基因的自主節(jié)律。本研究闡明了光波長通過褪黑素信號調(diào)控禽類外周生物鐘的機制，為理解光環(huán)境對禽類生理節(jié)律的影響提供了新見解。
在自然界中，從微小的藍藻到復(fù)雜的人類，幾乎所有生物都演化出了順應(yīng)地球自轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的明暗周期的內(nèi)在計時器——生物鐘。這個精密的系統(tǒng)不僅調(diào)控著我們的睡眠與覺醒，也深刻影響著新陳代謝、免疫應(yīng)答等眾多生理過程。對于鳥類而言，其生物鐘系統(tǒng)尤為特別，它們擁有三個“中央起搏器”：視交叉上核、視網(wǎng)膜和松果體，共同協(xié)調(diào)全身的節(jié)律。光，作為最主要的“授時因子”，其屬性（如周期、強度和波長）的變化會顯著影響生物鐘。隨著人類活動帶來日益嚴重的光污染，研究不同波長的人工光源如何影響生物節(jié)律，特別是對經(jīng)濟禽類的影響，變得至關(guān)重要。
以往研究表明，單色光能影響雞體內(nèi)時鐘基因的表達節(jié)律，而激素褪黑素參與了這一過程。褪黑素需要通過與細胞膜上的受體（如Mel1a, Mel1b, Mel1c）或細胞核內(nèi)的受體（RORα）結(jié)合來發(fā)揮作用。然而，這些受體自身的表達是否也存在晝夜節(jié)律？不同波長的光（如紅光、綠光、藍光）又會如何影響這些受體的節(jié)律？更重要的是，不同的褪黑素受體對肝臟時鐘基因的表達各自起著怎樣的調(diào)控作用？這些問題尚不清晰。為了回答這些疑問，研究人員在《Poultry Science》上發(fā)表了題為“Circadian rhythm of melatonin receptors under monochromatic light and their regulatory effect on clock genes in the chick liver”的研究論文，系統(tǒng)揭示了單色光通過調(diào)節(jié)褪黑素受體節(jié)律來調(diào)控雛雞肝臟生物鐘的分子機制。
研究人員綜合運用了多項關(guān)鍵技術(shù)來開展這項研究。在體實驗中，他們使用新孵化的Arbor Acres肉雞雛雞建立動物模型，通過手術(shù)建立假手術(shù)組和松果體切除組，并分別置于白光、紅光、綠光、藍光四種單色LED光下飼養(yǎng)兩周。在特定時間點（每隔4小時，共6個點）采集肝臟樣本。在離體實驗中，他們分離培養(yǎng)了雛雞原代肝細胞，并通過添加特定的褪黑素受體激動劑或拮抗劑進行干預(yù)。基因和蛋白表達分析主要采用實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qPCR）和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot），數(shù)據(jù)的晝夜節(jié)律分析則運用了余弦分析等生物節(jié)律經(jīng)典分析方法。
Circadian rhythm of melatonin receptor expression in the chick liver
研究首先確認了雛雞肝臟中四種褪黑素受體（Mel1a, Mel1b, Mel1c, RORα）的mRNA和蛋白表達均存在顯著的晝夜節(jié)律。其中，膜受體Mel1a和Mel1b的節(jié)律振蕩幅度最強。有意思的是，它們的節(jié)律相位并不相同：Mel1a的表達高峰出現(xiàn)在主觀夜晚，而Mel1b、Mel1c和核受體RORα的高峰則出現(xiàn)在主觀白天。這提示不同的受體可能受到差異化的轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。
Effect of monochromatic light and pinealectomy on the circadian rhythm of melatonin membrane receptor expression
接下來，研究深入探討了單色光和松果體切除對褪黑素膜受體節(jié)律的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，光波長能顯著改變膜受體的節(jié)律參數(shù)，且綠光和紅光的作用往往相反。具體而言，綠光普遍增強了三種膜受體（Mel1a, Mel1b, Mel1c）mRNA和蛋白節(jié)律的中值水平和振幅；而紅光則傾向于削弱這些節(jié)律參數(shù)。藍光的影響相對有限，主要提升了Mel1b的節(jié)律。當研究人員切除雛雞的松果體（褪黑素的主要分泌器官）后，膜受體的節(jié)律振蕩被顯著削弱，表現(xiàn)為中值水平和振幅的大幅下降，尤其是Mel1a受體的節(jié)律幾乎被“抹平”。更重要的是，松果體切除后，不同單色光之間在調(diào)節(jié)受體節(jié)律上的差異也大大減小甚至消失。這表明，松果體及其分泌的褪黑素是光波長調(diào)控肝臟褪黑素膜受體節(jié)律的關(guān)鍵中介。
Effect of monochromatic light and pinealectomy on the circadian rhythm of melatonin nuclear receptor expression
與膜受體的情況形成有趣對比的是，褪黑素核受體RORα的節(jié)律對光波長的響應(yīng)模式幾乎相反。紅光增強了RORα節(jié)律的中值和振幅，而綠光則表現(xiàn)出削弱作用。此外，松果體切除并未減弱RORα的節(jié)律，反而普遍增強了其節(jié)律振蕩。這些結(jié)果提示，褪黑素的膜受體信號通路與核受體信號通路在響應(yīng)光環(huán)境變化時可能存在不同的甚至相反的調(diào)節(jié)機制。
Effect of melatonin receptor on clock gene expression and intrinsic rhythm in hepatocytes
最后，研究在細胞水平上直接驗證了不同褪黑素受體對時鐘基因的調(diào)控作用。在原代培養(yǎng)的雛雞肝細胞中，添加褪黑素可普遍上調(diào)七個核心時鐘基因（cClock, cBmal1, cBmal2, cCry1, cCry2, cPer2, cPer3）的表達。通過使用特定的受體拮抗劑，研究人員發(fā)現(xiàn)：Mel1a的激活可誘導(dǎo)全部七個時鐘基因的表達；而Mel1b和Mel1c的激活則能誘導(dǎo)其中五個基因（cClock, cBmal2, cCry2, cPer2, cPer3）的表達，對cBmal1和cCry1無影響。使用RORα的激動劑SR1078也能誘導(dǎo)所有七個時鐘基因的表達。此外，在長期培養(yǎng)的肝細胞中，褪黑素的處理能夠增強cBmal1基因表達的自主振蕩幅度，并延遲cPer2基因的表達峰值，證明了褪黑素具有引導(dǎo)和維持肝細胞內(nèi)在生物鐘節(jié)律的能力。
本研究得出以下核心結(jié)論：首先，雛雞肝臟中的褪黑素受體表達存在明顯的晝夜節(jié)律，且不同受體的節(jié)律相位各異。其次，單色光能特異性調(diào)控這些受體的節(jié)律，其中綠光增強膜受體節(jié)律，紅光增強核受體RORα節(jié)律，而松果體及其分泌的褪黑素是光波長產(chǎn)生這些效應(yīng)的必要中介。最后，在肝細胞中，不同褪黑素受體的激活能夠誘導(dǎo)核心時鐘基因的表達，并且褪黑素能夠引導(dǎo)肝細胞時鐘基因的自主節(jié)律。
這項研究的重要意義在于，它系統(tǒng)性地闡釋了光波長（單色光）作為外部環(huán)境信號，如何通過影響褪黑素信號通路中關(guān)鍵元件（受體）的晝夜節(jié)律，進而精細調(diào)控肝臟這一重要外周器官生物鐘的分子機制。研究不僅揭示了禽類復(fù)雜生物鐘系統(tǒng)對光環(huán)境響應(yīng)的新層面，也強調(diào)了松果體-褪黑素軸在此過程中的核心樞紐作用。這些發(fā)現(xiàn)增進了我們對人工光環(huán)境如何影響禽類生理健康的理解，為家禽養(yǎng)殖中通過優(yōu)化光照策略（如使用特定波長的光）來改善禽類福利、健康和生產(chǎn)力提供了潛在的理論依據(jù)。同時，研究中所揭示的膜受體與核受體在節(jié)律調(diào)控上的不同響應(yīng)模式，也為未來深入研究褪黑素信號通路的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)指明了方向。
