要理解果實(shí)軟化，首先得從“骨架”開始——植物細(xì)胞壁。它可不是一堵簡(jiǎn)單的墻，而是一個(gè)由多種復(fù)雜多糖、結(jié)構(gòu)蛋白和酚類化合物構(gòu)成的精密三維網(wǎng)絡(luò)。在薔薇科果實(shí)的果肉中，細(xì)胞壁主要有三層：初生壁、胞間層和次生壁。次生壁木質(zhì)化程度高，通常存在于木質(zhì)部和纖維細(xì)胞中，在果肉中較為少見。真正決定果實(shí)強(qiáng)度和剛性的，是薄而有彈性的初生壁，以及富含果膠、位于細(xì)胞之間的胞間層。

構(gòu)成細(xì)胞壁的多糖主要分為三類，它們共同決定了“骨架”的堅(jiān)固與柔韌：

在果實(shí)成熟過(guò)程中，細(xì)胞壁會(huì)動(dòng)態(tài)改變其組成和結(jié)構(gòu)。這個(gè)過(guò)程由一系列分泌到細(xì)胞壁空間的酶和蛋白質(zhì)介導(dǎo)。這些“拆卸工人”協(xié)同工作，有序地“解構(gòu)”細(xì)胞壁。例如，擴(kuò)展蛋白(EXP)會(huì)“撬松”纖維素-半纖維素網(wǎng)絡(luò)；木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶/水解酶(XTH)負(fù)責(zé)降解半纖維素主鏈；β-半乳糖苷酶(β-Gal)負(fù)責(zé)移除果膠和半纖維素的側(cè)鏈；果膠酯酶(PE)負(fù)責(zé)果膠的去乙酰化和去甲酯化；而聚半乳糖醛酸酶(PG)和果膠酸裂解酶(PL)則進(jìn)一步降解暴露出來(lái)的果膠主鏈。這些酶的共同作用導(dǎo)致纖維素、半纖維素和果膠的解聚，果膠側(cè)鏈中性糖的丟失，最終使得細(xì)胞粘附力下降，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞壁變薄、密度降低，果實(shí)也就變軟了。

EXP是一類非酶類的細(xì)胞壁蛋白，被認(rèn)為是打破半纖維素與纖維素之間相互作用的“先鋒”。它像一把“鑰匙”，能松開纖維素和半纖維素之間的“鎖扣”，使其更容易被后續(xù)的降解酶攻擊，從而促進(jìn)細(xì)胞壁松弛。在薔薇科中，草莓的FaEXP2、FaEXP5，蘋果的MdEXPA16/20，以及桃的PpEXP3等基因在果實(shí)成熟過(guò)程中表達(dá)量上升，與軟化過(guò)程正相關(guān)。蘋果的MdEXLB1在番茄中異位表達(dá)可促進(jìn)番茄軟化。此外，梨中的PbEXPB3b/4a表達(dá)升高與果皮微裂紋形成相關(guān)，表明EXP基因不僅影響果肉硬度，還可能影響果皮強(qiáng)度。不過(guò)，多數(shù)關(guān)于EXP基因的研究基于表達(dá)模式推斷其功能，通過(guò)基因編輯等方法進(jìn)行的功能驗(yàn)證仍然缺乏。

EGase，也被稱為纖維素酶，可能作用于纖維素-木葡聚糖網(wǎng)絡(luò)，水解具有連續(xù)(1,4)-β-葡糖基殘基的聚合物。在薔薇科中，梨和草莓的EGase基因表達(dá)水平與軟化同步上升。黑莓RuEG1或RuEG2在番茄中異位表達(dá)可促進(jìn)軟化。有趣的是，反向遺傳學(xué)手段（如反義抑制）敲低草莓的EGase基因（FaEG1, FaEG3）對(duì)果實(shí)硬度幾乎沒(méi)有影響，這暗示單個(gè)基因的沉默可能不足以顯著影響果實(shí)軟化過(guò)程。在番茄中，同時(shí)敲除SlCel2和一個(gè)擴(kuò)展蛋白基因SlExp1才能增強(qiáng)果實(shí)硬度，說(shuō)明細(xì)胞壁降解是由多個(gè)基因協(xié)同作用控制的。

XTH編碼的酶具有木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶(XET)活性或木葡聚糖內(nèi)水解酶(XEH)活性，它們?cè)诩?xì)胞壁松弛相關(guān)的發(fā)育過(guò)程（如果實(shí)軟化）中起著重要作用。XEH不可逆地水解木葡聚糖聚合物，而XET則是非水解切割，但有時(shí)又能重新連接木葡聚糖鏈，參與細(xì)胞壁重塑。櫻桃的PavXTH14/15、蘋果的MdXTH3/25/26/28、桃的XTH33以及林叢草莓的FvXTH6/9等在果實(shí)發(fā)育和成熟過(guò)程中表達(dá)量大幅增加。其中PavXTH14/15、MdXTHB和FvXTH6/9的瞬時(shí)過(guò)表達(dá)被證實(shí)可促進(jìn)果實(shí)軟化。但同樣，它們尚未通過(guò)穩(wěn)定的反向遺傳學(xué)策略（如基因編輯）進(jìn)行功能驗(yàn)證。

果膠的穩(wěn)態(tài)由不同的果膠調(diào)節(jié)酶控制。其中，果膠酯酶包括果膠乙酰酯酶(PAE)和果膠甲酯酶(PME)。PAE催化細(xì)胞壁的去乙酰化和乙酸鹽的釋放，導(dǎo)致果膠內(nèi)聚力喪失。PME催化HG的去甲酯化，產(chǎn)生游離羧基并釋放質(zhì)子。PME有兩種作用模式：塊狀模式和隨機(jī)模式。塊狀模式下的去甲酯化HG可以與Ca²⁺交聯(lián)形成“雞蛋盒”結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)細(xì)胞間粘附，使細(xì)胞壁變硬。而在隨機(jī)模式下，PME改變了果膠性質(zhì)，形成去甲酯化的HG，成為其他果膠調(diào)節(jié)酶的底物。由于成熟果實(shí)通常呈酸性，這可能促使PME以隨機(jī)模式工作，從而促進(jìn)軟化。

在蘋果中，通過(guò)VIGS沉默MdPAE10可顯著增加果肉硬度。在桃中，Prupe.7G192800在溶質(zhì)桃果實(shí)發(fā)育過(guò)程中表達(dá)升高。在林叢草莓中，瞬時(shí)沉默FvPME38/39可延遲果膠降解和軟化，而過(guò)表達(dá)則起相反作用。因此，與果實(shí)相關(guān)的PME基因有望作為控制果實(shí)軟化的候選基因。

PG是一類催化去酯化聚半乳糖醛酸分解的酶，是果膠降解的最后步驟之一。根據(jù)水解活性，PG分為內(nèi)切-PG、外切-PG和鼠李-PG。其中，內(nèi)切-PG被廣泛認(rèn)為是果實(shí)硬度的主要決定因素。在薔薇科家族中，內(nèi)切-PG活性在櫻桃、桃和黑莓的果實(shí)成熟過(guò)程中增加，與軟化相關(guān)。編碼內(nèi)切-PG的基因已在薔薇科各物種中被廣泛鑒定。蘋果PG1反義抑制可增強(qiáng)細(xì)胞粘附和果實(shí)硬度。櫻桃PavPG38、桃PpPG、梨PcPG1/2均被發(fā)現(xiàn)與果實(shí)質(zhì)地決定相關(guān)。在草莓中，敲低FaPG1或FaPG2可顯著增加果實(shí)硬度，但聯(lián)合抑制并未顯示出更強(qiáng)的疊加效應(yīng)。然而，馴化和后續(xù)的定向選擇可能已經(jīng)固定了大多數(shù)功能性PG等位基因，這給育種項(xiàng)目的應(yīng)用留下了有限空間。

PL是另一類催化去酯化聚半乳糖醛酸分解的酶，導(dǎo)致果膠溶解。與PG的水解降解不同，PL催化β-消除反應(yīng)，隨機(jī)切割半乳糖醛酸殘基之間的α-1,4鍵，在果膠寡糖中產(chǎn)生不飽和雙鍵。PL基因是另一組在薔薇科中廣泛鑒定、被認(rèn)為與果實(shí)硬度相關(guān)的關(guān)鍵基因。在桃中，沉默PpePL1或PpePL15可延遲果膠解聚并增加采后硬度。在栽培草莓中，敲低FaPL1可產(chǎn)生更硬的成熟果實(shí)，且不影響顏色、可溶性固形物或花青素含量。在林叢草莓中，FvePL1、FvePL4和FvePL7的過(guò)表達(dá)和沉默均證實(shí)了它們?cè)谲浕�中的作用。在蘋果中，瞬時(shí)過(guò)表達(dá)MdPL5會(huì)增加硬度。番茄的CRISPR/Cas雙敲除研究表明，PL對(duì)果實(shí)軟化的主導(dǎo)作用超過(guò)了PG。相比之下，薔薇科的證據(jù)表明，PL和PG對(duì)軟化的貢獻(xiàn)大致相等。但大多數(shù)研究依賴于瞬時(shí)過(guò)表達(dá)或基因沉默，可能存在劑量和脫靶效應(yīng)，仍需CRISPR/Cas敲除（包括雙基因編輯）來(lái)嚴(yán)謹(jǐn)評(píng)估PL和PG對(duì)果實(shí)硬度的功能。

β-Gal是一種糖基水解酶，可從果膠和半纖維素側(cè)鏈的非還原末端移除β-D-半乳糖基殘基。細(xì)胞壁結(jié)合半乳糖基殘基的減少，與該酶相關(guān)，是果實(shí)成熟過(guò)程中最明顯的細(xì)胞壁組成變化之一。半乳糖基殘基的丟失可能增加細(xì)胞壁孔隙度，增強(qiáng)其他酶對(duì)細(xì)胞壁的降解。在蘋果中，β-Gal對(duì)采后果實(shí)硬度損失的影響比PG和PME更大。蘋果Mdβ-GAL2、梨PpGAL1/4、桃PpBGAL16的表達(dá)在成熟期升高。VIGS沉默PpBGAL16可增強(qiáng)桃果實(shí)硬度。草莓Faβ-Gal4的反義抑制減少了軟化，但也減小了果實(shí)大小。盡管梨和蘋果的β-Gal基因與軟化正相關(guān)，但這些基因尚未通過(guò)基因編輯等反向遺傳學(xué)研究進(jìn)行功能分析，其潛在的副作用也未知。

RGL參與降解RG-I主鏈。在幾種軟果（如黑莓、蘋果、梨、草莓）中，RGL活性在采收前即可檢測(cè)到，可能有助于果實(shí)軟化。在草莓中，已鑒定出17個(gè)編碼RGL的基因。其中，果實(shí)特異性FaRGLyase1受ABA誘導(dǎo)，在成熟期表達(dá)升高。RNAi沉默FaRGLyase1可增強(qiáng)成熟果實(shí)硬度。但值得注意的是，FaRGLyase1在草莓不同物種中表現(xiàn)出不同的表達(dá)譜，表明它可能也參與營(yíng)養(yǎng)組織的細(xì)胞擴(kuò)張，其功能缺失可能導(dǎo)致多效性副作用。目前，RGL對(duì)果實(shí)硬度的功能僅在草莓屬中得到驗(yàn)證，其他薔薇科果實(shí)仍需驗(yàn)證。

果實(shí)硬度是一個(gè)復(fù)雜性狀，由多個(gè)細(xì)胞壁修飾和降解基因共同控制。因此，編輯多個(gè)此類基因預(yù)計(jì)比對(duì)單個(gè)基因編輯產(chǎn)生更強(qiáng)的硬度效應(yīng)。然而，在異交和多倍體物種中，同時(shí)靶向多個(gè)基因在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性。因此，靶向控制細(xì)胞壁酶網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(TF)可能是一個(gè)更實(shí)用的策略。

MADS-box基因在多種發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮基礎(chǔ)作用，特別是花器官發(fā)育的調(diào)控。在薔薇科中，C類SHP亞組基因與果實(shí)發(fā)育相關(guān)。桃PpPLENA在番茄中異位表達(dá)導(dǎo)致果實(shí)變軟，并上調(diào)β-GAL、PME、EXP等軟化相關(guān)基因。草莓FaSHP的下調(diào)可顯著抑制FaPG1、FaPL、FaEG1等硬度相關(guān)基因。然而，在蘋果中，SHP同源基因與果實(shí)硬度的關(guān)聯(lián)不顯著，這可能反映了Malus基因組中旁系同源基因的功能冗余。

A類FRUITFULL基因和E類SEPALLATA亞組基因也參與果實(shí)軟化調(diào)控。櫻桃PaMADS7、中國(guó)櫻桃CpMADS47、溶質(zhì)桃PrupeSEP1和草莓FaMADS9的抑制與果實(shí)成熟和軟化延遲相關(guān)。軟化延遲主要?dú)w因于多種細(xì)胞壁基因的下調(diào)。進(jìn)一步研究表明，PG、PME、EXP基因是SEP TFs常見且直接的下游靶標(biāo)。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在高等植物中廣泛存在，在調(diào)控脅迫響應(yīng)和發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用。它們參與果實(shí)成熟，特別是細(xì)胞壁降解的作用，僅被部分探索。在林叢草莓中，FvWRKY48通過(guò)W-box元件結(jié)合FvPLA啟動(dòng)子，從而增強(qiáng)FvPLA表達(dá)，導(dǎo)致果膠降解增強(qiáng)和果實(shí)軟化。在草莓中，FaWRKY29和FaWRKY64的瞬時(shí)沉默可顯著減少灰霉病感染，這可能是由于幾個(gè)PME基因表達(dá)減少所致。這些變化可能改變果膠重塑和細(xì)胞壁降解，從而增強(qiáng)果皮對(duì)病原體入侵的抵抗力。因此，WRKY基因可能調(diào)控草莓等薔薇科物種的果皮強(qiáng)度，但仍需穩(wěn)定的基因驗(yàn)證。

NAC基因，如番茄的NAC-NOR和SlNOR-like1，與果實(shí)軟化相關(guān)。在薔薇科家族中，草莓、桃和蘋果中也鑒定出NAC基因。草莓FaNAC035（番茄NAC-NOR和NOR-like1的同源基因）在果實(shí)組織中特異性表達(dá)。RNAi沉默FaRIF會(huì)導(dǎo)致草莓果實(shí)質(zhì)地更硬。CRISPR敲除林叢草莓FvRIF也能增強(qiáng)果實(shí)硬度。分子實(shí)驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)vRIF蛋白結(jié)合FvPL2、FvPG2、FvEXP3的啟動(dòng)子，正向調(diào)控其表達(dá)。在桃中，PpNAC1（番茄NAC-NOR的同源基因）調(diào)控桃果實(shí)軟化相關(guān)基因PpPME1、PpPG1、PpPL1的表達(dá)。在蘋果中，NAC18.1的遺傳變異與蘋果果實(shí)質(zhì)地差異相關(guān)。另一個(gè)NAC，MdNAC1-L，通過(guò)激活MdPL5啟動(dòng)子活性來(lái)增強(qiáng)成熟和軟化。NAC基因在果實(shí)硬度中的作用在植物家族間似乎是保守的，因此它們可能是有希望的目標(biāo)。

轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)源植物激素的下游或并行發(fā)揮作用，這些激素調(diào)控果實(shí)成熟。薔薇科家族包含躍變型和非躍變型果實(shí)。乙烯是躍變型果實(shí)成熟的主要調(diào)節(jié)因子，而ABA是非躍變型果實(shí)成熟的核心調(diào)節(jié)因子。NAC和MADS-box基因似乎是全局成熟調(diào)節(jié)因子，在不同果實(shí)類型中具有保守作用。在躍變型薔薇科物種（如蘋果、桃）中，MdNAC1-L和PpNAC1誘導(dǎo)乙烯生物合成基因表達(dá)。在非躍變型物種中，FaRIF和FvRIF調(diào)控ABA相關(guān)基因的表達(dá)。在草莓中，FaSHP似乎位于FaRIF的下游，并受ABA調(diào)控。此外，在非躍變型薔薇科果實(shí)中涉及的轉(zhuǎn)錄因子，如FvRIF、FvWRKY48、PaMADS7，都對(duì)ABA有響應(yīng)。總之，這些研究表明上述TFs在躍變型和非躍變型果實(shí)類型中具有調(diào)控果實(shí)硬度的保守功能，這使它們成為增加薔薇科果實(shí)硬度的有希望的候選者。

細(xì)胞壁降解基因的功能缺失等位基因是隱性的，只有當(dāng)所有活性等位基因都發(fā)生突變時(shí)才會(huì)表現(xiàn)出強(qiáng)烈表型。對(duì)于自交可育的二倍體作物（如桃）的育種者來(lái)說(shuō)，由于此類作物的遺傳學(xué)和育種相對(duì)簡(jiǎn)單，可以很容易地獲得純合隱性突變體。然而，對(duì)于異交和多倍體作物，如蘋果和栽培草莓，情況則復(fù)雜得多。幸運(yùn)的是，CRISPR-Cas等精確基因編輯技術(shù)為在多倍體、異交作物中有效創(chuàng)造和利用隱性功能缺失等位基因提供了革命性的工具。通過(guò)使用多基因編輯或編輯上游主效轉(zhuǎn)錄因子，可以更有效地實(shí)現(xiàn)對(duì)硬度性狀的改良。本文綜述的知識(shí)將有助于設(shè)計(jì)高效策略，將這些基因應(yīng)用于旨在提高薔薇科作物貨架期的育種計(jì)劃中。