《Postharvest Biology and Technology》：Biocontrol efficacy and mechanisms of
Bacillus proteolyticus L181 against postharvest sour rot of citrus
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柑橘酸腐病生物防治研究中發現枯草芽孢桿菌L181及其揮發性有機物可有效抑制病原菌孢子萌發、菌絲生長和孢子形成，通過轉錄組學揭示其干擾病原菌代謝通路，誘導宿主抗氧化酶活性增強，體內試驗證實其顯著降低病害發生率和嚴重程度，GC-MS鑒定出2-甲基丁酸等關鍵抑菌VOCs，為開發環保的生物防治策略提供理論依據。
賴偉強|梁宇|李行洲|龍超安
中國華中農業大學國家柑橘種質創新與利用重點實驗室、國家柑橘保存技術研發中心、國家柑橘育種中心，武漢430070
摘要
由Geotrichum citri-aurantii真菌引起的柑橘酸腐病是柑橘收獲后最具破壞性的病害之一，會導致嚴重的品質下降和巨大的經濟損失。目前對柑橘酸腐病的管理主要依賴化學殺菌劑；然而，由于殺菌劑抗性、殘留問題和環境風險，其使用受到越來越嚴格的限制。本研究評估了蛋白酶解桿菌（Bacillus proteolyticus）L181對Geotrichum citri-aurantii的生物防治潛力。L181菌株及其揮發性有機化合物（VOCs）在體外顯著抑制了孢子萌發、菌絲生長和孢子形成。顯微鏡觀察顯示，VOCs導致菌絲變形，包括斷裂、收縮和細胞質顆粒化。轉錄組分析表明，VOCs暴露下調了Geotrichum citri-aurantii的關鍵代謝途徑，包括MAPK信號傳導、氮代謝、糖酵解和丙酮酸代謝。酶活性測定表明，L181菌株通過誘導過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化苯甲酰酶（PAL）增強了柑橘的抗性。體內實驗驗證了其在降低病害發生率和嚴重程度方面的有效性。此外，L181還對多種收獲后病原體表現出廣泛的抗真菌作用。GC-MS分析鑒定出10種揮發性物質，其中2-甲基丁酸和3-甲基丁酸具有強抗真菌活性。這些發現突顯了L181菌株作為柑橘酸腐病生物防治劑的潛力。
引言
柑橘果實因其獨特的風味和高營養價值而在全球廣泛種植，是消費者最喜愛的水果之一（Zheng等人，2025年）。在中國，超過90%的柑橘以新鮮形式消費，年產量超過6000萬噸，約占全球柑橘產量的60%（Li等人，2025年）。然而，柑橘果實極易在收獲、儲存、運輸和銷售過程中受到病原微生物的侵害，導致嚴重的經濟損失（Li等人，2025年）。因此，減輕收獲后病原體侵染并延長柑橘的儲存期和保質期已成為研究和產業界關注的重點領域（OuYang等人，2022年）。
在各種柑橘收獲后病害中，由Geotrichum citri-aurantii引起的酸腐病長期以來被認為是全球范圍內最普遍和最具破壞性的病害之一（Wang等人，2022年）。這種病原體在柑橘生產區廣泛分布，是導致柑橘酸腐病的主要原因，會導致組織迅速軟化和嚴重的收獲后損失（Klein和Kupper，2018年；Zhao等人，2025年）。目前廣泛使用的化學殺菌劑如噻苯達唑、嘧菌酯和咪唑菌胺對酸腐病的防治效果有限（Ai等人，2025年）。此外，這些殺菌劑的濫用和殘留問題引發了對人類健康和環境安全的嚴重擔憂（OuYang等人，2022年）。雖然熱水處理和UV-C輻射等物理方法有效，但通常需要專用設備，并可能損害柑橘的感官和理化品質，從而限制了其實際應用（Zhou等人，2024年）。因此，開發安全、可持續的柑橘酸腐病控制策略至關重要，這些策略應符合環境和人類健康的要求。
近年來，利用微生物拮抗作用來控制收獲后果實病害已成為一種可持續策略（Zhou等人，2024年）。在各種化學殺菌劑的替代方案中，生物防治因其環保和安全性而具有最大的潛力（Zhang等人，2025年）。在多種生物防治劑中，蛋白酶解桿菌屬（Bacillus spp.）因其強大的環境適應性、形成抗逆內孢子的能力以及產生多種代謝產物的能力而受到廣泛關注（Etesami等人，2023年）。蛋白酶解桿菌屬是一種革蘭氏陽性細菌，具有生物防治和促進植物生長的雙重特性（Prasad等人，2023年）。該菌屬具有快速繁殖、廣泛分布以及對人類和環境的低風險，使其成為管理水果和蔬菜病害的寶貴微生物資源（Lastochkina等人，2019年）。蛋白酶解桿菌屬的一個顯著特點是其多樣的次級代謝能力，其基因組約有5-8%編碼次級代謝產物的生成途徑，能夠產生多種拮抗化合物。其生物防治機制包括直接抑制植物病原體、誘導系統抗性（ISR）以及與病原體競爭生態位。多種蛋白酶解桿菌菌株在控制由真菌和細菌引起的植物病害方面表現出顯著效果。例如，Bacillus velezensis BV07及其代謝產物顯著抑制了Penicillium digitatum的菌絲生長（Zhu等人，2025年）。此外，Bacillus subtilis PM57和Bacillus cereus PM38顯著減少了由Erwinia carotovora pv.引起的玉米細菌性莖腐病（Ullah等人，2025年）。最近，一些新的蛋白酶解桿菌菌株顯示出良好的生物防治潛力。例如，Bacillus proteolyticus OSUB18在擬南芥中誘導了對假單胞菌（Pseudomonas syringae）和灰葡萄孢（Botrytis cinerea）的系統抗性（Yang等人，2023年）。此外，Bacillus proteolyticus MITWPUB1通過產生表面活性劑（BSs）抑制了由Sclerotium rolfsii引起的莖腐病（Mukadam等人，2024年）。然而，蛋白酶解桿菌對柑橘酸腐病的生物防治潛力及其機制仍不明確，缺乏系統的研究。因此，需要進一步的研究來闡明蛋白酶解桿菌在管理柑橘收獲后病害方面的潛力。
本研究分離出一種拮抗性細菌菌株L181，并初步鑒定為蛋白酶解桿菌。該菌株在體外對多種病原真菌表現出強烈的抗真菌活性，包括導致柑橘酸腐病的Geotrichum citri-aurantii，并能產生具有抗真菌特性的生物活性VOCs。因此，本研究旨在：（1）確定L181菌株在體外和體內抑制柑橘酸腐病的能力；（2）利用轉錄組方法分析L181衍生的VOCs熏蒸后Geotrichum citri-aurantii的全球轉錄反應；（3）評估L181菌株觸發宿主防御反應的潛力；（4）鑒定負責觀察到的活性的關鍵抗真菌VOCs。這些發現不僅擴展了具有生物防治潛力的蛋白酶解桿菌菌株的多樣性，還為開發環保的柑橘收獲后病害管理策略提供了理論和技術基礎。
部分摘錄
病原體和培養條件
本研究中使用的病原真菌包括Geotrichum citri-aurantii（AY-1）、Penicillium digitatum（P44, N1）、Penicillium italicum（P6）、Penicillium chrysogenum（Q, H）、Penicillium expansum（PTY-1, PTY-2）、Penicillium ulaiense（Pu）、Rhizopus stolonifer（MG）和Aspergillus niger（HQ）。所有真菌菌株均保存在華中農業大學的菌種庫中。菌株在25°C下于PDA培養基上預培養3-4天后進行后續實驗。
篩選抑制Geotrichum citri-aurantii的蛋白酶解桿菌菌株
實驗室保存的蛋白酶解桿菌菌株在28°C下的LB培養基中培養
L181菌株的CB對Geotrichum citri-aurantii表現出顯著的抑制作用
共篩選了27株蛋白酶解桿菌菌株，其中6株對Geotrichum citri-aurantii表現出顯著的抑制作用（圖1A）。在這6株菌株中，YB2和YB55產生的抑制暈圈相對較大（表1）。因此進行了二次篩選。在二次篩選過程中，雖然YB2和YB55之間的抑制暈圈大小沒有顯著差異，但YB2的透明區比YB55更大。因此，選擇YB2菌株進行進一步研究
討論
由Geotrichum citri-aurantii引起的酸腐病是柑橘果實收獲后最具破壞性的病害之一（Xu等人，2022年）。盡管化學殺菌劑仍是主要的控制方法，但對食品安全和環境可持續性的日益關注凸顯了生物防治替代方案的需求。然而，控制柑橘酸腐病特別具有挑戰性，因為沒有一種殺菌劑對Geotrichum citri-aurantii具有高度特異性，且其感染過程迅速且適應性強
結論
本研究表明，蛋白酶解桿菌L181是防治由Geotrichum citri-aurantii引起的柑橘酸腐病的有前景的生物防治劑。L181菌株及其VOCs在體外有效抑制了病原體的孢子萌發、菌絲生長和孢子形成。VOCs還導致真菌菌絲出現嚴重的形態和超微結構損傷。轉錄組分析表明，VOCs擾亂了與生長和毒力相關的多個代謝途徑，而酶活性測定
作者貢獻聲明
龍超安：撰寫 – 審稿與編輯、監督、資源管理、項目協調、資金獲取。李行洲：實驗研究、數據管理。梁宇：實驗研究、數據管理。賴偉強：撰寫 – 審稿與編輯、初稿撰寫、數據可視化、驗證、方法學設計、數據分析、概念構思。
利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文的研究結果。
致謝
本研究得到了中國國家自然科學基金（項目編號：32472407）、華中農業大學-AGIS合作基金（項目編號：SZYJY2023001）以及中國農業部（MOF）和農業農村部（MARA）中國農業研究系統的財政支持。
