在絲狀真菌Ashbya gossypii這類多核細(xì)胞中，細(xì)胞核分裂與菌絲尖端生長(zhǎng)是相互協(xié)調(diào)的關(guān)鍵過程，但它們通常發(fā)生在空間上相隔數(shù)百微米的位置。這引發(fā)了一個(gè)核心問題：這些過程是如何在局部被精確控制，又能實(shí)現(xiàn)全局協(xié)調(diào)的？本研究發(fā)現(xiàn)，RNA結(jié)合蛋白Whi3在其中扮演了樞紐角色。

先前研究表明，Whi3能夠形成生物分子凝聚體，并分別將G1期周期蛋白mRNA CLN3定位在細(xì)胞核附近，將成蛋白mRNA BNI1定位在菌絲尖端。本研究通過三維活細(xì)胞成像觀察到，Whi3凝聚體在菌絲尖端的存在與生長(zhǎng)速率呈負(fù)相關(guān)：尖端存在大凝聚體時(shí)，菌絲伸長(zhǎng)較慢。反之，在Whi3谷氨酰胺富集區(qū)缺失（ΔQRR）或模擬磷酸化的S637D突變體中，尖端凝聚體減少，菌絲生長(zhǎng)速率顯著加快。圍繞細(xì)胞核的Whi3凝聚體在數(shù)量、大小上也呈現(xiàn)顯著變化，并與細(xì)胞周期狀態(tài)相關(guān)。在G2/M期的細(xì)胞核周圍，凝聚體數(shù)量更少、體積更小。這些突變體細(xì)胞中凝聚體特征的改變，與此前觀察到的核分裂同步性增加、分枝模式異常等表型相符，表明Whi3凝聚體的動(dòng)態(tài)變化與細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂進(jìn)程緊密關(guān)聯(lián)。

為了探究Whi3凝聚體的分子功能，研究團(tuán)隊(duì)通過親和純化結(jié)合質(zhì)譜分析，鑒定了與Whi3相互作用的蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示，Whi3與大量核糖體組分、翻譯調(diào)節(jié)因子以及RNA降解因子存在相互作用，且這些相互作用大部分依賴于RNA的存在。這表明Whi3-RNA復(fù)合體可以作為支架，招募或直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后RNA穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)翻譯過程。

研究運(yùn)用一種基于鄰近連接和滾環(huán)擴(kuò)增的“三探針”策略，在單分子水平檢測(cè)內(nèi)源性mRNA與核糖體的關(guān)聯(lián)。驗(yàn)證該方法可靠后，將其應(yīng)用于研究 CLN3和 BNI1的翻譯空間模式。研究發(fā)現(xiàn)，CLN3mRNA的翻譯位點(diǎn)明顯富集在細(xì)胞核外圍，且翻譯活躍程度與細(xì)胞周期相關(guān)：M期核周圍的翻譯位點(diǎn)最多，其次是S/G2期，G1期最少。這表明 CLN3的翻譯在細(xì)胞周期特定窗口被局部激活。對(duì)于 BNI1mRNA，在野生型菌絲尖端雖然能觀察到mRNA的聚集，但翻譯信號(hào)卻很少。然而，在生長(zhǎng)更快、Whi3凝聚體更小的whi3(S637D)突變體中，菌絲尖端卻能檢測(cè)到 BNI1的翻譯信號(hào)增強(qiáng)。這說明Whi3的狀態(tài)影響了 BNI1在菌絲尖端翻譯的空間定位。

通過將上述翻譯檢測(cè)技術(shù)與Whi3蛋白的免疫熒光相結(jié)合，研究進(jìn)一步分析了翻譯事件與Whi3凝聚體的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CLN3在細(xì)胞核外圍的翻譯顯著富集于Whi3凝聚體上，而在細(xì)胞質(zhì)其他部位的翻譯則與Whi3信號(hào)關(guān)聯(lián)較弱。同樣，在菌絲尖端檢測(cè)到的少數(shù) BNI1翻譯事件，也往往與Whi3凝聚體相關(guān)。這表明，位于細(xì)胞核周圍和菌絲尖端的一部分Whi3凝聚體，確實(shí)是其靶標(biāo)mRNA局部翻譯發(fā)生的場(chǎng)所。

為了驗(yàn)證Whi3對(duì)翻譯的調(diào)控是否是其與靶RNA固有的特性，研究轉(zhuǎn)向體外實(shí)驗(yàn)體系。在兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解液體系中，將含有 CLN3或 BNI15‘非翻譯區(qū)的螢光素酶報(bào)告mRNA與不同濃度的Whi3蛋白混合。在低于相分離飽和濃度的低濃度下，翻譯活性變化不大。然而，在能形成凝聚體的高濃度下，翻譯結(jié)果呈現(xiàn)出復(fù)雜且RNA特異性的調(diào)控模式：CLN3報(bào)告mRNA的翻譯隨著Whi3濃度增加而呈現(xiàn)劑量依賴性的強(qiáng)烈抑制（最高超過100倍）；而 BNI1報(bào)告mRNA的翻譯則呈現(xiàn)出雙相反應(yīng)，在1 μM Whi3時(shí)翻譯增強(qiáng)（>2倍），在3 μM時(shí)則被強(qiáng)烈抑制。這種調(diào)控并非由RNA降解引起。當(dāng)使用相互作用減弱的突變體蛋白（whi3(ΔQRR)或whi3(S637D)）時(shí)，翻譯抑制被削弱，甚至出現(xiàn)增強(qiáng)，且形成的凝聚體更小。同樣，突變Whi3在mRNA上的結(jié)合位點(diǎn)以降低RNA價(jià)態(tài)，也會(huì)減輕翻譯抑制。值得注意的是，在所有條件下，翻譯抑制的程度與形成的凝聚體面積呈正相關(guān)。通過離心人為融合小液滴形成更大凝聚體的實(shí)驗(yàn)證明，在總濃度不變的情況下，更大的凝聚體尺寸本身與更強(qiáng)的翻譯抑制相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，Whi3蛋白與其靶RNA的固有特性足以產(chǎn)生濃度、凝聚體大小和分子間相互作用強(qiáng)度依賴的、多樣化的翻譯輸出結(jié)果。

為了直接觀察翻譯相對(duì)于Whi3凝聚體的空間位置，研究采用了“MoonTag”實(shí)時(shí)翻譯報(bào)告系統(tǒng)。當(dāng)攜帶MoonTag肽編碼序列的報(bào)告mRNA被翻譯時(shí)，新生的肽鏈會(huì)立即結(jié)合熒光標(biāo)記的納米抗體，從而報(bào)告翻譯延伸過程。在體外，Whi3與報(bào)告mRNA預(yù)孵育形成凝聚體后，再加入翻譯體系。結(jié)果顯示，兩種報(bào)告mRNA形成的Whi3凝聚體都頻繁地與點(diǎn)狀的MoonTag信號(hào)相關(guān)聯(lián)，且該信號(hào)依賴于活躍的翻譯過程，而非已翻譯肽鏈的被動(dòng)招募。在RNA結(jié)合位點(diǎn)突變體或whi3(S637D)突變體形成的凝聚體上，MoonTag信號(hào)更強(qiáng)，這與螢光素酶實(shí)驗(yàn)中觀察到的翻譯抑制減弱或增強(qiáng)現(xiàn)象一致，支持凝聚體致密相可以直接調(diào)節(jié)翻譯的觀點(diǎn)。

深入分析發(fā)現(xiàn)，MoonTag信號(hào)在凝聚體內(nèi)的分布并非均勻，而是在凝聚體外圍（界面）處最為富集。熒光標(biāo)記的核糖體在凝聚體上也呈現(xiàn)類似的界面富集分布。這種界面富集現(xiàn)象具有特異性：當(dāng)使用RNA結(jié)合位點(diǎn)突變的報(bào)告mRNA時(shí)，翻譯信號(hào)峰值會(huì)向凝聚體內(nèi)部偏移；而使用whi3(S637D)形成的凝聚體，其內(nèi)部甚至顯示出翻譯信號(hào)的富集。將界面翻譯信號(hào)強(qiáng)度按mRNA濃度歸一化后分析發(fā)現(xiàn)，較小的凝聚體通常與更強(qiáng)的單位RNA翻譯活性相關(guān)聯(lián)。這表明，凝聚體的尺寸和界面特性共同塑造了翻譯的局部環(huán)境。一個(gè)最小化的質(zhì)量平衡模型顯示，盡管凝聚體只占溶液總體積的一小部分，但其內(nèi)部特定的翻譯效率足以解釋在整體（批量）測(cè)量中觀察到的RNA特異性翻譯行為。

本研究系統(tǒng)揭示了Whi3生物分子凝聚體在調(diào)控多核真菌細(xì)胞生長(zhǎng)與分裂中的核心作用。這些凝聚體不僅僅是mRNA的儲(chǔ)存和定位載體，更是一個(gè)動(dòng)態(tài)的翻譯調(diào)控平臺(tái)，能夠根據(jù)亞細(xì)胞位置、細(xì)胞狀態(tài)（如細(xì)胞周期）以及凝聚體自身的理化性質(zhì)（如大小、組分、相互作用強(qiáng)度），對(duì)其靶標(biāo)mRNA CLN3和 BNI1的翻譯在抑制與激活之間進(jìn)行連續(xù)、精細(xì)的切換。在體內(nèi)，這種調(diào)控體現(xiàn)為 CLN3在細(xì)胞周期特定階段（M期）于核周局部爆發(fā)式翻譯，以及 BNI1在菌絲尖端受到計(jì)量式翻譯，從而協(xié)調(diào)核分裂異步性與極性生長(zhǎng)。在體外，僅需Whi3蛋白及其靶RNA即可重現(xiàn)這種復(fù)雜調(diào)控，其機(jī)制與凝聚體尺寸及界面特性密切相關(guān)。Whi3凝聚體通過生成一個(gè)翻譯狀態(tài)的連續(xù)譜，實(shí)現(xiàn)了對(duì)關(guān)鍵調(diào)控蛋白局部豐度的精確時(shí)空調(diào)控，這為理解生物分子凝聚體如何整合全局信號(hào)、執(zhí)行局部生化反應(yīng)，從而協(xié)調(diào)多核細(xì)胞等大型細(xì)胞中空間分離的生命過程，提供了重要的范例和機(jī)制見解。