氣候變化、環(huán)境退化和化石燃料枯竭帶來(lái)的日益嚴(yán)峻挑戰(zhàn)正在推動(dòng)全球向通過(guò)環(huán)保工業(yè)生物技術(shù)實(shí)現(xiàn)高價(jià)值生化產(chǎn)品的可持續(xù)生產(chǎn)方向發(fā)展[1]。傳統(tǒng)制造方式因環(huán)境法規(guī)、倫理問(wèn)題以及有限資源而面臨越來(lái)越多的限制，這凸顯了基于可再生生物質(zhì)開發(fā)穩(wěn)健生物工藝的必要性[2]。在可再生原料中，海洋生物質(zhì)因其快速生長(zhǎng)、高光合作用效率以及對(duì)土地和淡水資源與糧食作物的競(jìng)爭(zhēng)較小而具有吸引力[3]。特別是，紅藻富含基于半乳糖的硫酸化多糖，如瓊脂和κ-卡拉膠，這些多糖無(wú)需苛刻預(yù)處理即可通過(guò)酶法糖化為D-半乳糖[4]。然而，大多數(shù)先前的研究主要集中在單獨(dú)水解瓊脂或κ-卡拉膠上，往往忽略了從混合多糖生物質(zhì)中協(xié)同回收總碳水化合物的可能性。盡管已經(jīng)使用了諸如κ-卡拉膠酶CgkA或β-瓊脂酶和α-新瓊脂糖水解酶的組合，但實(shí)現(xiàn)完全糖化仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)[5]、[6]。這種生化復(fù)雜性構(gòu)成了一個(gè)重大瓶頸，因?yàn)榛旌霞t藻中的頑固結(jié)構(gòu)連接需要多目標(biāo)酶法處理才能實(shí)現(xiàn)完全液化。在這項(xiàng)研究中，開發(fā)了一種由五種酶組成的協(xié)同酶系統(tǒng)：AgaA、AgaB、AhgA、CgkA和IdsA3，專門用于克服混合瓊脂和κ-卡拉膠的結(jié)構(gòu)異質(zhì)性。這種有序的酶法處理方法解決了海洋生物質(zhì)的生化復(fù)雜性問(wèn)題，為后續(xù)的微生物轉(zhuǎn)化提供了穩(wěn)健的上游工藝。

源自紅藻的半乳糖已成為一種有前景的微生物原料，但其用于生產(chǎn)高價(jià)值藥物（如膽紅素BR）的應(yīng)用仍尚未得到充分探索[7]、[8]、[9]。長(zhǎng)期以來(lái)，膽紅素被認(rèn)為是一種有毒廢物，因?yàn)槠湓诟邼舛认戮哂猩窠?jīng)毒性[10]。然而，最近的研究表明，膽紅素是一種強(qiáng)效的抗氧化劑和抗炎劑，對(duì)心血管和神經(jīng)退行性疾病具有顯著的治療潛力[4]、[11]、[12]、[13]。盡管具有潛力，但目前膽紅素的供應(yīng)主要依賴于動(dòng)物膽汁的提取，但這受到產(chǎn)量低、成本高、污染風(fēng)險(xiǎn)以及倫理問(wèn)題的限制。純化膽紅素的高市場(chǎng)價(jià)格加上動(dòng)物來(lái)源供應(yīng)鏈的不穩(wěn)定性，凸顯了迫切需要一種可持續(xù)的、基于生物的替代方案[14]。雖然已經(jīng)證明了膽紅素的化學(xué)合成方法，但需要多個(gè)復(fù)雜步驟且整體產(chǎn)率較低，因此在大規(guī)模應(yīng)用上不切實(shí)際[15]。因此，迫切需要可持續(xù)且可擴(kuò)展的生物技術(shù)方法來(lái)解決這一限制。

微生物生物合成膽紅素代表了一種有前景的環(huán)保解決方案，結(jié)合了發(fā)酵的可擴(kuò)展性和過(guò)程控制。雖然合成生物學(xué)的進(jìn)步使得在工程宿主中生產(chǎn)膽紅素成為可能，但許多現(xiàn)有策略仍然嚴(yán)重依賴精煉的碳源和昂貴的前體外源補(bǔ)充。在大腸桿菌中通過(guò)工程化血紅素降解實(shí)現(xiàn)了膽紅素的生物合成，在Streptomyces atratus（一種天然產(chǎn)生的紅霉素生產(chǎn)菌）中，膽綠素和膽紅素被證明是次要代謝產(chǎn)物，這表明放線菌具有替代的生物合成能力[9]、[16]。盡管這些研究證實(shí)了微生物合成膽紅素的潛力，但它們主要依賴葡萄糖作為碳源，引發(fā)了關(guān)于食物競(jìng)爭(zhēng)和成本的擔(dān)憂[17]。此外，像大腸桿菌這樣的革蘭氏陰性宿主的內(nèi)毒素譜和監(jiān)管限制使其不太適合藥物應(yīng)用。還有一些研究使用微生物宿主菌株作為全細(xì)胞催化劑，通過(guò)生物轉(zhuǎn)化將外源提供的前體（如血紅素或膽綠素）轉(zhuǎn)化為膽紅素[18]、[19]。盡管這些方法展示了高轉(zhuǎn)化效率，但它們依賴于昂貴的前體補(bǔ)充，并不構(gòu)成真正的從糖類“從頭”合成膽紅素的過(guò)程（表1）。

作為工業(yè)微生物底盤，Corynebacterium glutamicum在卟啉衍生分子的生物合成方面具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。作為一種公認(rèn)安全（GRAS）的微生物，它已經(jīng)證明是大規(guī)模生產(chǎn)氨基酸、化學(xué)品和生物燃料的可靠平臺(tái)。重要的是，C. glutamicum在C5途徑上的代謝通量異常高，這是卟啉和血紅素生物合成的關(guān)鍵代謝途徑[7]、[20]、[21]、[22]。雖然膽紅素的產(chǎn)生常常受到卟啉中間體的細(xì)胞毒性和高NADHP需求的限制，但C. glutamicum通過(guò)其內(nèi)在活躍的PP途徑表現(xiàn)出對(duì)氧化應(yīng)激的強(qiáng)大耐受性，提供了優(yōu)越的氧化還原環(huán)境。這種生理韌性對(duì)于穩(wěn)定像膽紅素這樣的光敏和氧化還原活性分子至關(guān)重要。此外，它不產(chǎn)生內(nèi)毒素，并且具有利用多種底物的代謝靈活性，使其成為可持續(xù)膽紅素合成的強(qiáng)大平臺(tái)[23]。另外，C. glutamicum避免了與革蘭氏陰性宿主相關(guān)的限制和安全風(fēng)險(xiǎn)，從而增加了其工業(yè)應(yīng)用的可能性。

本研究提出了一個(gè)集成平臺(tái)，包括兩個(gè)優(yōu)化模塊：紅藻的先進(jìn)酶法糖化和在C. glutamicum中從半乳糖“從頭”合成膽紅素（圖1）。通過(guò)分別優(yōu)化這些階段，建立了一個(gè)功能性的海洋生物精煉原型。定制的酶組合高效水解了紅藻多糖（包括瓊脂和卡拉膠），增加了可用的半乳糖量。將合成的半乳糖吸收途徑引入C. glutamicum，使其能夠有效吸收半乳糖。策略性地過(guò)表達(dá)了膽紅素生物合成基因，同時(shí)下調(diào)了競(jìng)爭(zhēng)途徑以增強(qiáng)向膽紅素的轉(zhuǎn)化流量。優(yōu)化了生成NADPH的途徑以提高NADPH水平。據(jù)我們所知，這是首次使用GRAS宿主從半乳糖合成膽紅素的報(bào)道。除了生產(chǎn)之外，合成的膽紅素還表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性，證明了其作為生物活性分子的潛力。通過(guò)將上游糖化與下游生物合成相結(jié)合，這種方法提供了一種可擴(kuò)展的、可持續(xù)的高價(jià)值生化產(chǎn)品生產(chǎn)路線。這項(xiàng)工作確立了紅藻作為下一代微生物生產(chǎn)功能性生物活性分子的有希望的原料。