胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)是一種極具侵襲性的癌癥，其5年生存率極低，對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷(ICB)療法具有顯著的耐藥性。這種耐藥性源于其獨(dú)特的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境(TME)。代謝重編程，特別是線粒體功能障礙，是塑造PDAC免疫抑制TME的關(guān)鍵因素之一。本研究旨在通過(guò)鑒定一個(gè)能夠同時(shí)破壞癌細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)并增強(qiáng)其免疫原性的靶點(diǎn)，為克服PDAC治療困境提供新策略。研究人員首先通過(guò)定制的單引導(dǎo)RNA(sgRNA)文庫(kù)進(jìn)行CRISPR-Cas9篩選，在PDAC患者來(lái)源異種移植(PDX)模型中系統(tǒng)性地尋找對(duì)腫瘤生長(zhǎng)至關(guān)重要的線粒體代謝依賴基因。功能性驗(yàn)證分析揭示，線粒體FAD依賴性巰基氧化酶——生長(zhǎng)因子、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)¹(GFER)，是調(diào)控PDAC腫瘤生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，GFER的缺失擾亂了細(xì)胞的氧化還原平衡，并顯著刺激了腫瘤的免疫原性，包括對(duì)ICB治療的敏感性增強(qiáng)。在PDAC的PDX模型中，GFER缺失所誘導(dǎo)的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)是通過(guò)改變氧化平衡介導(dǎo)的，這種改變導(dǎo)致受損的線粒體DNA(mtDNA)釋放到腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活cGAS-STING通路并表達(dá)I型干擾素(IFN)。這一效應(yīng)在小鼠免疫正常的同源PDAC模型中得以重現(xiàn)，其中GFER缺失抑制了腫瘤生長(zhǎng)，并促進(jìn)了T細(xì)胞浸潤(rùn)，從而增強(qiáng)了腫瘤殺傷效果。最終，GFER缺失顯著增強(qiáng)了ICB療法的抗腫瘤療效。這些發(fā)現(xiàn)共同確立了GFER作為PDAC中線粒體氧化還原穩(wěn)態(tài)和免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，并為使PDAC對(duì)ICB治療敏感化揭示了一個(gè)新的治療機(jī)會(huì)。

PDAC是一種高度惡性的癌癥，其5年生存率約為8%。ICB療法雖然已成功改變了其他多種侵襲性癌癥的治療格局，但對(duì)PDAC的療效有限。這種耐藥性主要?dú)w因于PDAC獨(dú)特的免疫抑制性TME。PDAC的TME以免疫細(xì)胞、基質(zhì)成分和癌細(xì)胞衍生因子之間復(fù)雜的相互作用為特征。癌基因如突變的c-MYC和KRAS（后者在超過(guò)90%的PDAC病例中被檢出）會(huì)募集免疫抑制性髓系細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)，從而抑制抗原識(shí)別級(jí)聯(lián)反應(yīng)并激活癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)。這些成分共同作用，通過(guò)建立一個(gè)保護(hù)PDAC細(xì)胞免受免疫監(jiān)視的免疫抑制性生態(tài)位，來(lái)抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性。盡管近期在克服PDAC TME挑戰(zhàn)方面已有諸多努力，例如靶向突變KRAS的療法可通過(guò)募集T細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞到PDAC TME中來(lái)引發(fā)免疫反應(yīng)，從而增強(qiáng)這種典型的“冷”腫瘤的免疫原性，但這類療法常因快速出現(xiàn)的獲得性耐藥而受限，這凸顯了尋找不同機(jī)制以克服或逆轉(zhuǎn)PDAC免疫抑制TME的緊迫性。代謝重編程是PDAC細(xì)胞高增殖率和強(qiáng)大生存機(jī)制的特征，并有助于塑造PDAC的免疫抑制TME。線粒體作為細(xì)胞過(guò)程中的關(guān)鍵信號(hào)樞紐，已被確定為PDAC治療耐藥和TME重編程的重要貢獻(xiàn)者。功能失調(diào)的線粒體會(huì)損害細(xì)胞能量和氧化還原平衡，并影響參與PDAC進(jìn)展的關(guān)鍵信號(hào)通路。代謝重編程、線粒體功能障礙和PDAC免疫抑制成分之間復(fù)雜的相互作用表明，靶向線粒體可能會(huì)增強(qiáng)免疫原性，從而使PDAC細(xì)胞暴露于免疫監(jiān)視之下。本研究發(fā)現(xiàn)，GFER是一個(gè)線粒體因子，其抑制既能改變胰腺癌細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)，又能增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)癌細(xì)胞的識(shí)別。GFER在線粒體過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，包括線粒體蛋白質(zhì)折疊和鐵-硫簇(ISC)的轉(zhuǎn)運(yùn)。此外，GFER是電子傳遞鏈(ETC)的電子供體，而ETC是氧化磷酸化(OXPHOS)所必需的，從而為正常細(xì)胞功能供能。然而，GFER在腫瘤生長(zhǎng)中的作用尚不明確。本研究證明，GFER抑制會(huì)增加TME中適應(yīng)性免疫反應(yīng)的成分，從而揭開(kāi)了被TME“偽裝”起來(lái)的PDAC細(xì)胞，使其暴露于免疫系統(tǒng)。TME中的這些變化使PDAC細(xì)胞對(duì)ICB治療敏感，從而將GFER定位為增強(qiáng)PDAC治療反應(yīng)的一個(gè)有前景的候選靶點(diǎn)。

為探索線粒體在PDAC細(xì)胞增殖中的作用，研究團(tuán)隊(duì)建立了一個(gè)靶向1,166個(gè)核編碼線粒體基因的sgRNA文庫(kù)，并在三個(gè)來(lái)源于早期傳代PDAC PDX模型的細(xì)胞系中進(jìn)行了CRISPR-Cas9基因敲除篩選。通過(guò)這種方法，他們鑒定出多個(gè)對(duì)PDAC細(xì)胞生長(zhǎng)至關(guān)重要的基因，這些基因與線粒體氧化還原系統(tǒng)和特定的線粒體代謝相關(guān)。為在體內(nèi)功能驗(yàn)證這些候選基因，研究人員將靶向前五個(gè)候選基因的sgRNA與多西環(huán)素誘導(dǎo)型CRISPR-Cas9載體一同導(dǎo)入PDX來(lái)源的細(xì)胞，隨后將這些細(xì)胞植入免疫缺陷小鼠。移植后，啟動(dòng)多西環(huán)素治療以誘導(dǎo)CRISPR介導(dǎo)的GFER、GPX4、NFS1、ABCB7或SOD1基因敲除。盡管敲除其他四個(gè)基因也觀察到了生長(zhǎng)抑制反應(yīng)，但在GFER缺失的PDAC腫瘤中觀察到了最強(qiáng)的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。GFER缺失并未顯著改變這些相關(guān)氧化還原或線粒體基因的表達(dá)。因此，研究人員選擇GFER進(jìn)行深入研究。GFER已被報(bào)道在肝癌細(xì)胞系中參與線粒體代謝和ETC，但其在調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)中的作用尚不清楚。為深入了解GFER在PDAC中的作用，研究團(tuán)隊(duì)用sgGFER或?qū)φ誷gCTRL轉(zhuǎn)染了PDX來(lái)源的PATC124和PATC148細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)GFER缺陷導(dǎo)致PDAC細(xì)胞的克隆形成和成球能力顯著下降。一致地，在異種移植模型中，觀察到GFER缺失顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)，而這種抑制效應(yīng)可被表達(dá)sgRNA抗性GFER所挽救。綜合來(lái)看，這些數(shù)據(jù)提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，表明GFER缺失影響PDAC生長(zhǎng)。鑒于GFER在癌癥依賴圖(DepMap)數(shù)據(jù)庫(kù)的大多數(shù)癌細(xì)胞系中都被評(píng)分為一類必需基因，研究團(tuán)隊(duì)測(cè)試了GFER敲除對(duì)正常胰腺細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)化細(xì)胞相比，GFER缺失不影響正常胰腺細(xì)胞的生長(zhǎng)。此外，與正常胰腺組織相比，GFER在小鼠胰腺上皮內(nèi)瘤變和胰腺腫瘤中的表達(dá)顯著升高，這表明正常胰腺組織對(duì)GFER的依賴性可能低于腫瘤組織。

與其在維持ETC功能中的作用一致，在PATC細(xì)胞中敲除GFER降低了線粒體耗氧率(OCR)，并伴隨線粒體活性氧(ROS)水平的顯著升高。由于GFER通過(guò)其在ISC輸出中的作用間接影響線粒體基質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)中的多種細(xì)胞活動(dòng)，研究團(tuán)隊(duì)評(píng)估了GFER缺失對(duì)細(xì)胞質(zhì)順烏頭酸酶活性和GPAT蛋白水平的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在兩種GFER缺陷的PATC細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)順烏頭酸酶活性和GPAT蛋白水平均顯著降低，這表明GFER是PDAC細(xì)胞中ISC輸出及相關(guān)功能所必需的。接下來(lái)，為理解GFER缺陷對(duì)PDAC細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)是由于誘導(dǎo)了細(xì)胞死亡和/或抑制了細(xì)胞周期進(jìn)展，研究團(tuán)隊(duì)觀察到GFER缺失并未誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡；相反，它與G1期細(xì)胞的積累和S期細(xì)胞的急劇減少相關(guān)。進(jìn)一步的證據(jù)表明，GFER缺失增加了DNA損傷標(biāo)志物γH2AX和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21的表達(dá)水平，表明細(xì)胞周期阻滯可能是由誘導(dǎo)的DNA損傷和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制所導(dǎo)致的。此外，長(zhǎng)期的GFER缺失會(huì)誘導(dǎo)一種類似衰老的表型，其特征是β-半乳糖苷酶染色增加且對(duì)吉西他濱的敏感性降低。綜合來(lái)看，體外研究表明，GFER缺陷對(duì)PDAC細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用可能是通過(guò)損害PDAC線粒體功能、增加線粒體氧化應(yīng)激和細(xì)胞周期阻滯來(lái)介導(dǎo)的。

為闡明GFER缺失對(duì)PDAC細(xì)胞抗增殖作用的分子機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)GFER缺陷和表達(dá)的PATC細(xì)胞進(jìn)行了批量RNA測(cè)序(RNA-seq)。分析揭示了與線粒體功能和細(xì)胞周期進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵通路顯著下調(diào)，這與之前證明GFER缺陷導(dǎo)致線粒體功能障礙和細(xì)胞周期阻滯的數(shù)據(jù)一致。值得注意的是，在GFER缺陷的PDAC細(xì)胞中，未折疊蛋白反應(yīng)(UPR)通路被上調(diào)，這一點(diǎn)通過(guò)GFER缺失后PDAC細(xì)胞中所有線粒體UPR相關(guān)基因表達(dá)增加得到了證實(shí)。差異基因表達(dá)分析揭示了在GFER缺失72小時(shí)后，PDX細(xì)胞中大量基因表達(dá)上調(diào)。在這些上調(diào)的基因中，觀察到谷胱甘肽特異性γ-谷氨酰環(huán)轉(zhuǎn)移酶1的表達(dá)增加，它通過(guò)催化GSH的裂解來(lái)維持細(xì)胞內(nèi)的氧化平衡，并作為促凋亡因子參與UPR。為評(píng)估CHAC1在介導(dǎo)GFER缺陷抗增殖效應(yīng)中的作用，研究團(tuán)隊(duì)在GFER缺陷和表達(dá)的PATC細(xì)胞中敲除了CHAC1。盡管單獨(dú)敲除CHAC1并未顯著影響集落形成，但在GFER缺失的背景下敲除CHAC1可部分挽救集落形成。正如基于CHAC1表達(dá)增加所預(yù)期的那樣，在GFER缺陷的PDAC細(xì)胞系中觀察到GSH水平顯著降低。為闡明GSH耗竭在GFER下調(diào)后對(duì)PDAC生長(zhǎng)的影響，研究人員向PDX PATC細(xì)胞提供了外源性GSH，這減輕了GFER缺失的抗增殖效應(yīng)。GSH補(bǔ)充挽救了GFER缺陷以及GFER/CHAC1雙敲除細(xì)胞的增殖。這些發(fā)現(xiàn)共同表明，通過(guò)CHAC1調(diào)節(jié)GSH穩(wěn)態(tài)對(duì)于GFER介導(dǎo)的人PDAC細(xì)胞生長(zhǎng)控制至關(guān)重要。

由于腫瘤細(xì)胞的代謝重編程已被證明可以改變免疫抑制的PDAC TME，接下來(lái)研究團(tuán)隊(duì)調(diào)查了GFER缺失對(duì)PDAC免疫微環(huán)境的影響。有趣的是，RNA-seq分析揭示了GFER缺失后，包括IFNα、IFNγ、TNFα信號(hào)、炎癥反應(yīng)和IL2–STAT5信號(hào)在內(nèi)的幾種免疫相關(guān)通路上調(diào)，這暗示了GFER在免疫調(diào)節(jié)中的潛在作用。為深入研究這一點(diǎn)，研究團(tuán)隊(duì)在免疫正常的小鼠模型中，使用來(lái)源于KRAS^G12D， Trp53^R172H， p48-Cre小鼠模型的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了GFER敲低(KD)或敲除(KO)實(shí)驗(yàn)。與在人細(xì)胞中的數(shù)據(jù)一致，在KPC細(xì)胞中敲低GFER導(dǎo)致集落形成顯著減少。隨后，研究團(tuán)隊(duì)將GFER-KD或表達(dá)的KPC細(xì)胞原位植入C57BL/6小鼠。對(duì)來(lái)自GFER-KD模型的腫瘤進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示，與對(duì)照組相比，與免疫反應(yīng)相關(guān)的基因和信號(hào)通路上調(diào)。此外，觀察到與T細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)的多種趨化因子（如CXCL10和CXCL11）在GFER-KD腫瘤中表達(dá)增加。一致地，對(duì)原位KPC腫瘤進(jìn)行的流式細(xì)胞術(shù)免疫分型顯示，在GFER-KD腫瘤中，CD8⁺T細(xì)胞（占CD45⁺細(xì)胞的比例），特別是活化的CD8⁺T細(xì)胞顯著增加，而其他免疫細(xì)胞亞群，包括CD4⁺T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞則保持不變。CD8⁺T細(xì)胞的細(xì)胞毒活性通過(guò)免疫熒光分析得到進(jìn)一步證實(shí)，該分析顯示CD8⁺T細(xì)胞浸潤(rùn)與GFER-KD腫瘤中的腫瘤細(xì)胞死亡高度相關(guān)。值得注意的是，與對(duì)照組相比，GFER-KD腫瘤中成纖維細(xì)胞的比例顯著降低，這表明GFER缺失改變了基質(zhì)的組成。為了解CD8⁺T細(xì)胞在GFER-KD介導(dǎo)的腫瘤生長(zhǎng)抑制中的作用，研究團(tuán)隊(duì)在攜帶GFER-KD KPC腫瘤的小鼠中使用了抗CD8抗體來(lái)耗竭CD8⁺T細(xì)胞。CD8⁺T細(xì)胞的耗竭顯著減弱了GFER-KD的抗腫瘤效果，這表明CD8⁺T細(xì)胞是GFER缺失發(fā)揮抗腫瘤作用所必需的。鑒于GFER-KD腫瘤中免疫活化增強(qiáng)，研究團(tuán)隊(duì)測(cè)試了GFER缺失是否能增強(qiáng)PDAC對(duì)ICB治療的反應(yīng)。在皮下KPC腫瘤模型中，雖然抗PD-1單藥治療對(duì)腫瘤生長(zhǎng)影響甚微，但GFER-KD與抗PD-1聯(lián)合治療顯著抑制了腫瘤生長(zhǎng)，其效果優(yōu)于任一單藥治療。重要的是，在GFER-KD背景下，抗PD-1治療進(jìn)一步增加了腫瘤內(nèi)CD8⁺T細(xì)胞和活化的CD8⁺PD-1⁺Granzyme B⁺T細(xì)胞的浸潤(rùn)。臨床相關(guān)性方面，研究人員分析了癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)GFER高表達(dá)的PDAC患者總體生存期更短。此外，在PRINCE臨床試驗(yàn)的接受抗PD-1/抗CD40治療的患者中，GFER低表達(dá)的患者表現(xiàn)出更長(zhǎng)的總生存期趨勢(shì)。這些數(shù)據(jù)共同表明，GFER是PDAC的不良預(yù)后標(biāo)志物，并且GFER低表達(dá)可能預(yù)示著對(duì)ICB治療有更好的反應(yīng)。

鑒于GFER缺失上調(diào)了I型IFN信號(hào)通路，研究團(tuán)隊(duì)探究了其潛在的分子機(jī)制。在GFER缺陷的PDX細(xì)胞中，觀察到胞質(zhì)mtDNA水平顯著增加，這可能導(dǎo)致DNA傳感通路cGAS-STING的激活。與此一致，在GFER缺陷的PDX細(xì)胞中檢測(cè)到STING及其下游效應(yīng)物TBK1的磷酸化水平升高，以及I型IFN的表達(dá)增加。為驗(yàn)證cGAS-STING通路在GFER缺失介導(dǎo)的免疫激活中的作用，研究團(tuán)隊(duì)使用了STING拮抗劑H-151。H-151處理有效地阻斷了GFER-KD誘導(dǎo)的I型IFN產(chǎn)生，并部分逆轉(zhuǎn)了GFER-KD在體外對(duì)PDX細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。更重要的是，在體內(nèi)，H-151處理顯著削弱了GFER-KD的抗腫瘤效果，并減少了腫瘤內(nèi)CD8⁺T細(xì)胞的浸潤(rùn)。這些結(jié)果表明，GFER缺失通過(guò)釋放mtDNA激活cGAS-STING-I型IFN軸，從而驅(qū)動(dòng)抗腫瘤免疫。為探究GFER缺失導(dǎo)致的氧化還原失衡與cGAS-STING通路激活之間的聯(lián)系，研究團(tuán)隊(duì)測(cè)試了抗氧化劑能否逆轉(zhuǎn)免疫激活。用線粒體靶向抗氧化劑MitoQ或外源性GSH處理GFER缺陷細(xì)胞，可減少線粒體ROS的產(chǎn)生，抑制cGAS-STING通路的激活，并部分挽救細(xì)胞生長(zhǎng)。這些數(shù)據(jù)表明，GFER缺失導(dǎo)致的氧化還原失衡是mtDNA釋放和隨后的先天免疫激活的上游事件。

本研究通過(guò)系統(tǒng)的功能基因組學(xué)篩選，將線粒體酶GFER鑒定為PDAC的一個(gè)新的治療脆弱性靶點(diǎn)。GFER缺失通過(guò)雙重機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用：一方面，它破壞腫瘤細(xì)胞自身的氧化還原穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致線粒體功能障礙、GSH耗竭和細(xì)胞周期阻滯；另一方面，它通過(guò)釋放mtDNA激活cGAS-STING-I型IFN先天免疫通路，重塑免疫抑制性TME，增強(qiáng)CD8⁺T細(xì)胞浸潤(rùn)和活化，從而使“冷”的PDAC腫瘤對(duì)ICB治療敏感。這項(xiàng)研究的意義在于揭示了一個(gè)單一的分子靶點(diǎn)GFER，能夠同時(shí)調(diào)控癌細(xì)胞的代謝適應(yīng)性和免疫逃避能力。靶向GFER或其下游通路（如CHAC1/GSH軸或cGAS-STING軸）可能為PDAC提供一種新的聯(lián)合治療策略。特別是，將GFER抑制與現(xiàn)有的ICB療法相結(jié)合，有望克服PDAC對(duì)免疫治療的耐藥性，為這種致命性疾病帶來(lái)新的希望。未來(lái)的研究需要開(kāi)發(fā)特異性的GFER小分子抑制劑，并在更廣泛的臨床前模型和臨床試驗(yàn)中驗(yàn)證其療效與安全性。