核心碳代謝（CCM）包括三個相互關聯的途徑：糖酵解、戊糖磷酸途徑（PPP）和三羧酸（TCA）循環。這些代謝途徑通過提供能量、產生必需的生物合成前體以及維持細胞氧化還原平衡來支持核心生理功能。這些途徑的中間產物主要是糖磷酸鹽、相關有機酸和單糖，在細胞生物化學中起著關鍵作用。糖磷酸鹽作為細胞代謝中的重要中間體，參與能量產生、生物合成過程和信號轉導。例如，葡萄糖-6-磷酸（G6P）和果糖-6-磷酸（F6P）是糖酵解的關鍵中間產物，而核糖-5-磷酸（R5P）是PPP中核苷酸合成的關鍵前體。這些途徑的功能范圍還擴展到關鍵有機酸。琥珀酸和富馬酸等代謝物強調了糖酵解與TCA循環之間的代謝連續性，它們有效地將碳水化合物代謝與線粒體三磷酸腺苷（ATP）的生成、生物合成前體的供應以及細胞氧化還原調節聯系起來。這些代謝物的失調是多種疾病（包括癌癥、心血管疾病和神經退行性疾病）的標志。因此，準確定量CCM中的關鍵代謝物對于闡明生理和病理條件下的代謝調節至關重要。

然而，在生物樣本中同時分析CCM中的關鍵代謝物面臨兩個主要挑戰。首先，磷酸鹽、羧基、多羥基和氨基等可電離官能團的存在使這些化合物具有高度親水性，導致它們在常規反相色譜柱上的保留效果較差。盡管已經采用化學衍生化方法來改善色譜行為，但這引入了實際操作上的復雜性，如樣品處理難度增加、衍生化不完全以及副產物的形成。為了克服這一限制，人們探索了多維色譜、離子色譜和毛細管電泳-串聯質譜等技術；然而，這些技術通常需要復雜的儀器設備，或者不適合高通量生物分析。親水相互作用液相色譜（HILIC）-串聯質譜（HILIC-MS/MS）的采用標志著極性代謝物分析的一個進步。通過使用高pH值的流動相和惰性固定相，HILIC方法提供了更直接和穩健的解決方案。然而，這些方法的一個關鍵限制是它們依賴于高鹽濃度的流動相才能充分分離異構體（如果糖-6-磷酸/甘露糖-6-磷酸/葡萄糖-6-磷酸/葡萄糖-1-磷酸），這對長期質譜檢測帶來了實際挑戰。

其次，從復雜的生物基質（如血清）中高效且同時提取糖磷酸鹽、羧酸和多羥基糖仍然是一個主要分析難題，因為它們的物理化學性質各不相同。血清是一種特別復雜的基質，富含蛋白質、脂質和鹽類，這些成分可能導致離子抑制、非特異性吸附或與目標代謝物的不良化學反應。先前的研究表明，磷酸化化合物容易與血清中的內源性金屬離子形成金屬螯合物，從而顯著降低提取效率。基于金屬氧化物的親和色譜已被證明是選擇性捕獲磷酸化代謝物的有效工具。同樣，使用金屬螯合劑可以緩解特定磷酸化物種的金屬絡合問題。然而，這些方法通常僅適用于含磷酸基團的分子。目前仍缺乏一種通用策略，能夠同時提取血清中的這三類極性代謝物（包括糖磷酸鹽、羧酸和多羥基糖）。

因此，本研究的核心目標是建立一種有效的分離方法和統一的樣品制備方法，以便在復雜基質中分離CCM中的關鍵代謝物。為滿足這一關鍵需求，我們提出了一種HILIC-MS/MS方法，用于同時定量CCM框架內的35種結構多樣且生物學上重要的代謝物，其覆蓋范圍比以往報道的方法更廣。該方法利用了在完全優化條件下的親水相互作用色譜，包括柱子選擇、流動相組成、pH值和梯度條件。值得注意的是，加入了5 μM的MDP作為流動相添加劑，以改善對金屬離子敏感的分析物的峰形和響應。結果，成功分離出了所有35種目標代謝物，其中包括4組具有挑戰性的異構體（共11種異構體）。除了色譜分離外，該工作流程還包括一種基于EDTA輔助解離血清中代謝物-金屬離子螯合物的高效且易于應用的樣品提取策略。這種專門的預處理方法有助于完全提取廣泛的CCM代謝物，包括糖磷酸鹽、有機酸和多羥基單糖。為了進一步提高分析性能，我們開發了一種簡化的樣品清洗方案，顯著改善了所有分析物的分析響應和回收率。通過測量檢測限（LOD）、定量限（LOQ）、線性、真度（日內和日間）和基質效應（ME），完成了嚴格的方法驗證。總體而言，這種集成工作流程為復雜生物樣本中的關鍵CCM代謝物提供了一種準確、可靠且可重復的檢測方法，從而有助于深入研究它們在相關生物醫學研究中的功能作用。