《Talanta》：Endogenous enzyme-driven unarming of spherical nucleic acid in a divide-and-conquer pattern for amplified imaging of microRNA in tumor cells
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精準識別腫瘤細胞對早期診斷、預后評估和術后復發(fā)風險評價具有重要意義，但低豐度miRNA標記物的細胞內(nèi)成像面臨挑戰(zhàn)。本研究開發(fā)了一種基于DNA納米機器的AHP-AuNP探針，利用內(nèi)源性酶APE1驅動ERDN信號放大機制，實現(xiàn)miRNA-21的高靈敏度檢測（低至27.1 pM），無需轉染劑即可主動進入腫瘤細胞，通過熒光信號區(qū)分癌細胞與正常細胞，為癌癥早期診斷和精準治療提供工具。
作者：趙龍、黃洪、于新如、毛凱莉、楊宇曦、楊雄、徐立堅、吳在生
中國湖南省湘潭大學生物科學與醫(yī)學工程學院生物醫(yī)學納米材料與器件重點實驗室，湖南株洲，412007
摘要
雖然精確識別癌細胞對早期診斷、預測患者預后以及評估手術后復發(fā)風險具有重要意義，但對低豐度miRNA生物標志物的細胞內(nèi)成像仍然極具挑戰(zhàn)性，這主要是由于“一對一”信號轉導機制的局限性和傳感探針（尤其是多組分探針）在復雜生物環(huán)境中的脆弱性。本文介紹了一種基于AHP-AuNP納米探針的方法，該探針能夠敏感地放大并成像細胞內(nèi)的miRNA-21生物標志物。這種探針由金納米顆粒（AuNP）和一層DNA AHPs組成，DNA AHPs能夠識別含有AP位點的目標miRNA-21，而AP位點可以被內(nèi)切酶APE1切割。與癌癥相關的miRNA-21可以特異性地打開AHP-AuNP納米探針的環(huán)莖結構，從而觸發(fā)ERDN擴增反應。在此過程中，內(nèi)源性酶（E）、目標miRNA（R）、含有可切割AP位點的DNA探針（D）和金納米顆粒底物（N）被整合到一個檢測系統(tǒng)中，最終導致SNA的解構并產(chǎn)生敏感的熒光信號。即使只有一條DNA鏈參與信號傳導過程，也能檢測到低至27.1 pM的miRNA-21，檢測限提高了90倍。此外，該方法不受外源酶和miRNA家族成員的干擾，甚至能夠輕松檢測到單堿基錯配。而且，AHP-AuNP納米探針無需轉染劑即可進入活細胞，實現(xiàn)對細胞內(nèi)miRNA-21的敏感熒光成像，從而能夠區(qū)分癌細胞和健康細胞。預計AHP-AuNP納米探針將成為一種強大的診斷工具，用于特異性篩查患者體內(nèi)的腫瘤細胞，在癌癥的早期診斷、手術后的復發(fā)預測以及轉移評估方面具有巨大潛力。
引言
癌癥的發(fā)生不僅直接導致患者死亡，還會對患者造成嚴重的身體和心理創(chuàng)傷，對人類生命和健康構成嚴重威脅[1]。特異性識別癌細胞對于早期診斷至關重要，并為評估癌癥的進展和預后提供了寶貴信息[2]。腫瘤的不同階段決定了治療的難度，因此早期診斷對于降低患者死亡率非常重要[3][4][5]。通過設計一個簡單的分子檢測平臺，可以在活細胞中成像相關生物標志物，從而實現(xiàn)單細胞水平上的癌細胞定位，無需復雜的樣本處理過程，從而在形態(tài)異常之前揭示病理生理信息，便于早期診斷和精準治療[6][7][8]。近年來，可用于細胞內(nèi)成像的生物標志物（包括蛋白質[9]、端粒酶[10]、小分子[11]、金屬離子[12]和微小RNA（miRNAs）[13][14][15]）引起了廣泛的研究興趣，在精準生物醫(yī)學診斷方面具有巨大潛力。
miRNAs是由內(nèi)源基因編碼的非蛋白質編碼單鏈RNA分子，長度約為18-25個核苷酸。它們通過調(diào)節(jié)特定目標信使RNA（mRNAs）的活性，在基因調(diào)控中發(fā)揮重要作用，并參與多種生理和病理過程[16][17][18]。近年來，大量證據(jù)表明miRNAs與多種人類癌癥相關，因此成為潛在的生物標志物[19][20][21][22]。例如，miRNA-21的異常表達與多種惡性腫瘤（如慢性淋巴細胞白血病、肺癌、乳腺癌和宮頸癌）的增殖、侵襲、遷移和凋亡密切相關[23][24][25]。因此，對異常miRNA表達的敏感檢測和細胞內(nèi)成像對于癌癥的早期診斷、預后評估和治療反應評估至關重要。然而，miRNAs的低豐度、高同源性以及短序列給其表達分析帶來了巨大挑戰(zhàn)，尤其是在活細胞中的精確成像方面[26,27]。為了提高miRNA成像檢測平臺的性能，引入了多種信號放大策略來增強熒光生物傳感器的檢測靈敏度[28]，包括PCR（聚合酶鏈反應）[29,30]、RCA（滾環(huán)擴增）[31][32][33][34][35]、鏈置換擴增（SDA）[36][37][38]、催化發(fā)夾自組裝（CHA）[39][40][41]和雜交鏈反應（HCR）[42,43]。然而，由于生物功能組分的固有脆弱性，信號放大系統(tǒng)在復雜的細胞內(nèi)環(huán)境中難以表現(xiàn)出理想的檢測能力�；贒NA的納米機器作為重要的信號轉導器和放大器，在活細胞中的miRNA成像中受到了廣泛關注[44][45][46][47][48]，因為它們能夠實現(xiàn)“一對多”的信號放大，響應速度快，信號轉導效率高，技術簡單，特別適用于生物環(huán)境[49][50][51]。同時，一些催化生物反應的關鍵酶在病變細胞（包括癌細胞）中含量豐富，具有高效切割底物的能力[52]。因此，基于酶激活的檢測探針常被用于復雜介質中的miRNA檢測[53,54]。不幸的是，多組分探針往往因在惡劣的腫瘤內(nèi)環(huán)境中的結構分解而失活。結合含有最少DNA寡核苷酸的DNA納米機器和催化酶，有望通過敏感成像細胞內(nèi)miRNAs來準確區(qū)分癌細胞。
受到上述催化酶、DNA納米機器和miRNAs獨特性質的啟發(fā)，我們提出了一種基于內(nèi)源性酶（E）驅動的目標miRNA回收（R）信號放大方法，該方法利用含有酶切位點的DNA探針（D）和功能化的金納米顆粒（N）（稱為ERDN擴增）在活細胞中敏感成像miRNAs。選擇人類apurinic/apyrimidinic內(nèi)切酶1（APE1）作為內(nèi)源性驅動力，該酶主要存在于不同腫瘤細胞的細胞質中，在堿基切除修復中起關鍵作用[55][56][57]。APE1主要作用于雙鏈DNA中的AP位點[58,59]；最新研究表明，它也能在DNA/RNA雜交鏈的AP位點進行切割，盡管效率較低[60][61][62][63]。由于APE1在多種腫瘤細胞中的表達量通常高于正常細胞[64][65][66]，并且能夠通過去除AP位點來修復DNA損傷[54,67]，因此設計了一種熒光修飾的DNA發(fā)夾探針（稱為AHP），該探針含有AP位點，用于特異性識別與癌癥相關的miRNA-21。這種探針被固定在金納米顆粒（AuNP）表面，其熒光通過熒光共振能量轉移（FRET）被AuNP淬滅[68,69]，從而形成內(nèi)源性APE1驅動的AHP-AuNP納米探針（球形核酸，SNA）。由于核酸修飾的球形物體能夠被多種哺乳動物細胞主動內(nèi)化[70][71][72][73][74][75]，AHP-AuNP納米探針無需任何轉染劑即可進入腫瘤細胞，并通過直接利用內(nèi)源性APE1對細胞內(nèi)miRNA產(chǎn)生敏感的熒光響應，從而實現(xiàn)腫瘤細胞的特異性熒光成像。酶促反應和目標miRNA-21的回收導致SNA的內(nèi)源性解構。相比之下，正常細胞中缺乏miRNA-21和APE1，SNA保持結構完整，健康細胞不會產(chǎn)生可檢測的熒光信號，從而區(qū)分癌細胞和正常細胞，實現(xiàn)癌癥的早期診斷。由于其簡單的設計（僅涉及DNA探針）、結構穩(wěn)定性、高靈敏度和增強的特異性，所設計的AHP-AuNP納米探針有望成為評估和監(jiān)測患者腫瘤演變的有效工具，促進癌癥管理和精準醫(yī)學的發(fā)展。
試劑和材料
所有寡核苷酸均由上海Sangon Biotech有限公司自行設計和合成。寡核苷酸的序列列于表S1中。人類apurinic/apyrimidinic內(nèi)切酶1（APE1）、尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）和HpaII限制性內(nèi)切酶（HpaII）購自北京New England Biolabs有限公司。T4 DNA連接酶（T4）和phi29 DNA聚合酶（Phi29）購自蘇州Novoprotein有限公司。Tris-(2-carboxyethyl) phosphine（TCEP）和TE……
AHP-AuNP納米探針的設計及APE1驅動的細胞內(nèi)miRNA-21成像信號放大機制
圖1展示了AHP-AuNP納米探針（球形核酸，SNA）的設計及其相應的分子機制，該機制通過APE1驅動的ERDN信號放大，有助于區(qū)分腫瘤細胞和健康細胞�；诖罅筷P于腫瘤發(fā)生與miRNA-21異常表達之間關系的文獻報道（包括堿基突變[14,15,44,52][80][81][82][83][84][85]），我們設計了……
結論
總之，我們開發(fā)了一種基于內(nèi)源性APE1酶作為信號放大驅動力的AHP-AuNP納米探針（本質上是SNA探針），用于活細胞中的miRNA成像。顯然，信號轉導過程是通過細胞內(nèi)目標miRNA和內(nèi)源性酶的協(xié)同作用，使球形核酸探針以“分而治之”的方式解構，從而實現(xiàn)熒光信號放大。由于APE1……
作者貢獻聲明
趙龍：撰寫——原始草稿，數(shù)據(jù)整理，概念構思。
黃洪：數(shù)據(jù)整理，概念構思。
于新如：數(shù)據(jù)整理。
毛凱莉：數(shù)據(jù)整理。
楊宇曦：數(shù)據(jù)整理。
楊雄：數(shù)據(jù)整理。
徐立堅：資金獲取。
吳在生：撰寫——審稿與編輯，研究調(diào)查，資金獲取，概念構思。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的競爭性財務利益或個人關系可能影響本文的研究結果。
致謝
本研究得到了中國國家自然科學基金（NSFC）（項目編號：52374387）和中國國家自然科學基金（NSFC）（項目編號：22174020）的支持。我們感謝溫州醫(yī)科大學科研中心的優(yōu)秀咨詢和儀器支持。
