《Talanta》：A multi-ligand polymer-particle composite-based array chip for selective and simultaneous enrichment of phosphoproteins and glycoproteins
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本研究開發了一種基于TiO?納米顆粒的多配體聚合物芯片，可同時富集磷蛋白和糖蛋白。通過化學修飾固定Con A和PNA，優化吸附效果，驗證了α-casein、β-casein及GOD、OVAL的富集效率，顯著減少預處理步驟。
G.M. 阿帕爾娜 | 杰伊·奈克 | 桑吉特·庫馬爾 | 基肖爾·K.R. 特塔拉
生物分離技術中心（CBST），維洛爾理工學院（VIT），泰米爾納德邦維洛爾 – 632014，印度
摘要
在蛋白質組學研究中，從生物樣本中高效且選擇性地富集目標磷酸蛋白和糖蛋白至關重要。一個集成的磷酸蛋白和糖蛋白富集平臺可以減少多個富集前和富集后的步驟。在這項研究中，我們報告了一種在單個芯片內開發的多配體聚合物-顆粒復合材料，用于同時從同一樣本中富集磷酸蛋白和糖蛋白。合成了二氧化鈦（TiO2）顆粒（200-700納米），并使用傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）和場發射掃描電子顯微鏡（FE-SEM）對其進行了表征。兩種凝集素，即康康納瓦林A（Con A）和花生凝集素（PNA），分別被固定在環氧基和醛基修飾的TiO2顆粒上。FT-IR、X射線光電子能譜（XPS）和BCA測定法證實了凝集素的固定。在不同的TiO2顆粒表面修飾方法（雙氧環己烷、環氧氯丙烷、硅烷化以及硅烷化后與戊二醛交聯）中，凝集素在環氧氯丙烷和硅烷化顆粒上的固定效果最好。兩種糖蛋白（葡萄糖氧化酶（GOD）和卵白蛋白（OVAL）被Con A固定顆粒高效吸附。凝集素修飾顆粒和TiO2顆粒分別被整合到PolyHEMA整體結構中（FE-SEM圖像），并制成薄膜點（5 μL）放置在玻璃載玻片上。該陣列芯片吸附糖蛋白和磷酸蛋白所需的最大時間分別為80分鐘和120分鐘。納米液相色譜-質譜（Nano-LC-MS/MS）分析證實了從含有磷酸蛋白、糖蛋白、非磷酸蛋白和非糖蛋白的人工蛋白質混合物中成功且選擇性地富集了這兩種模型蛋白。
引言
蛋白質磷酸化和糖基化是兩種重要的翻譯后修飾（PTMs），在多種細胞活動中起著基礎性作用，包括信號轉導、免疫防御和代謝[1]、[2]、[3]、[4]。糖蛋白/磷酸蛋白數量的異常變化及其組成的結構變化與多種疾病的發生有關[5]、[6]、[7]、[8]。由于這些蛋白質在復雜生物樣本（包括人血）中的含量較低，因此識別它們非常困難[8]。質譜（MS）因其高通量和高靈敏度而被認為是識別PTMs的有效技術之一[9]。然而，技術障礙如離子化效率低、含量低以及大量未修飾共存物質對信號的抑制限制了PTMs的直接分析[2]。
在MS分析之前富集磷酸蛋白和糖蛋白是一種廣泛采用的策略。金屬氧化物親和層析（MOAC）[10]、[11]和固定金屬離子親和層析（IMAC）[2]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]用于磷酸蛋白的富集。凝集素親和層析[17]、[18]、[19]、硼酸酯親和層析[20]、[21]、[22]、[23]、肼化學[24]和親水相互作用層析（HILIC）[2]、[25]、[26]用于糖蛋白的富集。通過溶膠-凝膠方法制備的基于二氧化鈦的材料被用于從人血漿中捕獲糖蛋白[27]。近年來，已經開發出多種材料，可以從人血漿中同時分離磷酸蛋白和糖蛋白。黃等人開發了一種雙功能Poly EDMA-co-VPBA-co-VPA整體結構，可以通過基于硼酸酯親和和固定金屬親和的不同流動相進行調節和特異性富集[2]。鄒等人設計了一種多功能Ti4+固定樹狀聚甘油殼聚糖@PGMA@IDA納米材料（IMAC和HILIC），用于同時富集N-糖肽和磷酸肽[28]。孫等人合成了雙功能磁性Fe3O4@TiO2-IDA納米材料（MOAC和HILIC），一步富集糖肽和磷酸肽[29]。孟等人[30]開發了一種基于二肽的雙功能材料，用于同時捕獲磷酸肽和糖肽。陳等人[31]將IMAC和HILIC集成在一個移液器尖端，用于從植物中富集磷酸肽和糖肽。盡管這些策略證明了同時富集糖蛋白和磷酸蛋白的可行性，但需要多個手動富集前和富集后的步驟。
微陣列是一種能夠在單個芯片上集成數千個點的平臺。這一概念已被用于從生物流體中篩選藥物和生物標志物等[32]、[33]、[34]。玻璃、塑料、聚合物、硝化纖維素膜等各種基底被用作微陣列平臺。納米材料被整合到微陣列基底上[35]、[36]，以增加生物分子的固定效率并降低背景信號。然而，由于配體對分析物的可及性降低，形成密集的層狀納米顆粒薄膜是一個主要限制。因此，需要一種具有多孔性的薄膜來提高配體的可及性。整體材料[37]因其傳質能力和易于合成而被研究作為微陣列芯片上的薄膜[38]、[39]。與整體材料相比，納米材料具有更大的表面積和配體負載能力。整體材料能夠在其內部結構中有效保留納米顆粒/大顆粒[40]。從而提高了活性位點對目標分析物的可及性，克服了密集層狀納米顆粒微陣列的局限性。二氧化鈦（TiO
2）顆粒由于其高惰性和潛在的生物相容性，在多個行業中（如紙張、涂料、紡織品等）有廣泛應用。它們還以其出色的磷酸蛋白富集能力而聞名。最近，我們報道了整合了TiO
2顆粒的整體微柱[41]，并表明與單獨使用TiO
2顆粒相比，這些顆粒的磷酸蛋白吸附能力和可及性得到了提高。選擇這些顆粒用于凝集素固定是因為：
- TiO2顆粒表面修飾容易；
- 高表面積（271 m2/g）；
- 不需要或可能需要很少的材料制備重新優化（聚合物-顆粒組成）；
- 多功能性，即同一顆粒可以區分不同的PTMs
在這項工作中，將預聚合物摻雜的TiO2顆粒和預聚合物包覆的凝集素TiO2顆粒制成單個薄膜微點（直徑：0.35厘米），放置在單個玻璃載玻片（多配體陣列芯片）上。TiO2顆粒本身被用于捕獲磷酸蛋白。康康納瓦林A（Con A）和花生凝集素（PNA）是本研究中用于糖蛋白吸附的兩種模型植物凝集素。研究了不同的化學方法將凝集素固定在TiO2顆粒上，以及它們的選擇性糖蛋白識別能力和吸附動力學。所開發的多配體陣列芯片成功用于從自制的人工蛋白質混合物中同時捕獲磷酸蛋白（α-酪蛋白、β-酪蛋白）和糖蛋白（卵白蛋白（OVAL）和葡萄糖氧化酶（GOD）（通過SDS-PAGE和質譜分析）。
材料與方法
乙腈（ACN）、丙酮、氫氧化銨、磷酸銨、硫酸銨、2,2'-偶氮二（2-甲基丙氨酰胺）二鹽酸鹽（AMPA）、牛血清白蛋白（BSA）、1,4-丁二醇二縮水甘油醚（雙氧環己烷）、α-酪蛋白、β-酪蛋白、氯化鈣、康康納瓦林A（Con A）、N, N'-二烯丙基-L-酒石酰胺（DATD）、乙醇、乙醇胺、乙二胺、環氧氯丙烷、葡萄糖氧化酶（GOD）、戊二醛、2-羥基乙基甲基丙烯酸酯（HEMA）、鹽酸（HCl）、花生凝集素
凝集素固定TiO2顆粒的制備與表征
根據我們之前的研究[41]成功合成了球形TiO2顆粒，并用于固定兩種凝集素Con A和PNA。顆粒修飾使用了三種連接分子：環氧氯丙烷（EPI）、雙氧環己烷（BIS）和3-(glycidyloxypropyl)trimethoxy硅烷（Si）。固定策略從直接固定到間接固定不等，連接分子的長度也有所不同。選擇連接分子的目的是為了研究其影響
結論
在這項工作中，我們開發了一種簡單高效的多配體聚合物納米復合微陣列玻璃芯片，可以從單個樣本中同時富集和篩選磷酸蛋白和糖蛋白。在顆粒表面使用長連接分子增強了Con A修飾的TiO2顆粒對模型糖蛋白（GOD和OVAL）的吸附。PNA修飾的顆粒與模型α-甘露糖基化糖蛋白（GOD和OVAL）的相互作用可以忽略不計或很小。該陣列芯片能夠捕獲目標蛋白
CRediT作者貢獻聲明
阿帕爾娜 G M：可視化、驗證、調查、數據分析、數據管理。杰伊·奈克：調查、數據分析。桑吉特·庫馬爾：寫作 – 審稿與編輯、可視化、資源管理、概念構思。卡利·基肖爾·雷迪·特塔拉：寫作 – 審稿與編輯、可視化、監督、資源管理、項目管理、方法論、資金獲取、概念構思
數據可用性
所有報告的數據都在手稿和補充信息文件中提供
利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的利益沖突
利益沖突聲明
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致謝
基肖爾·K·R·特塔拉博士感謝科學與工程研究委員會（SERB）在核心研究資助計劃（文件編號CRG/2018/003889）下對這項研究的資助。作者感謝維洛爾理工學院的FE-SEM和FT-IR設施，以及TRivandrum的DBT-SAHAJ國家質譜設施為質譜實驗和分析提供的支持。
