《Talanta》：A novel laminar flow-based hierarchical microfluidic (LF-HM) chip for multiplex detection without cross-talk
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微流控芯片通過穩定層流實現垂直分離反應層消除交叉干擾，有限元模擬驗證流體分布和截留功能，實驗證明15-26℃條件下RF與ACPA聯檢無交叉 talk且與參考方法高度吻合（R2=0.85-0.95），為POCT提供通用解決方案。
楊曉輝|李一賢|程珊珊|穆榮榮|徐竹|Josh Zixi Lee|楊宇|李慧強
天津醫科大學醫學技術學院臨床免疫學系，中國天津市300203
摘要
微流控技術為即時檢測的多重檢測提供了一個有前景的平臺，具有極低的試劑消耗量，這符合對成本效益高診斷方法日益增長的需求。然而，由于不同檢測模式之間的相互干擾，將多種檢測方法集成到單個微通道中仍然具有挑戰性。在這項研究中，開發了一種基于層流的分層微流控（LF-HM）芯片，通過利用穩定的層流在單個微通道內創建兩個垂直分離的反應層來消除這種干擾。該設計通過有限元仿真進行了驗證，確認了關鍵功能，包括流體攔截和最小的流動干擾。實驗表征證實了穩定的層流，確定了15-26°C的最佳操作溫度范圍以最小化橫向擴散，并證明了完全消除了干擾。通過整合類風濕因子（RF）和抗瓜氨酸化蛋白抗體（ACPA）檢測方法，該芯片的有效性得到了最終驗證——這兩種方法在多重檢測中容易產生干擾，但在此芯片上的檢測結果與單參數檢測方法具有極佳的一致性（RF的Passing-Bablok斜率為0.99，ACPA的為1.02），并且在臨床驗證中與參考方法具有強相關性（RF的R2=0.85；ACPA的R2=0.95）。LF-HM芯片為無干擾的多重檢測提供了一種穩健且可推廣的解決方案，在傳統上受干擾限制的即時檢測應用中具有廣泛潛力。
引言
目前，最具代表性的即時檢測（POCT）方法是膠體金免疫層析法（GICA），該方法以其快速性和操作簡便性而聞名[1]。然而，其相對較低的靈敏度從根本上限制了其檢測能力和定量準確性。這一固有限制使得GICA主要適用于定性或半定量篩查[2,3]，常常阻礙其在需要精確臨床診斷或長期監測的場合中的應用[4]。在這種情況下，微流控技術已成為下一代POCT的變革性平臺[5,6]。通過在微尺度上實現精確的流體操控，微流控系統在微型化[7]、集成[8]和復雜分析過程的自動化[9]方面具有卓越的能力。這些系統不僅減少了試劑消耗和分析時間，還為高度集成的多分析物檢測平臺的發展提供了堅實的基礎，使其特別適合高性能POCT應用[6,10,11]。
然而，在傳統多重微流控系統的開發中，一個重大挑戰是當具有不同檢測模式的檢測方法集成到共享微通道中時所產生的干擾[12]。一個典型的例子是同時檢測抗瓜氨酸化蛋白抗體（ACPA）和類風濕因子（RF），這兩種是類風濕性關節炎的關鍵生物標志物[13,14]。ACPA檢測通常使用間接檢測模式[15]，該模式涉及標記抗人IgG抗體。這種抗體可能會非特異性地結合到RF夾心檢測中使用的固定化IgG Fc片段上，導致RF檢測點出現假陽性信號。同樣，在同時檢測病原體特異性IgM/IgG抗體時，由于同一通道中同時存在捕獲和間接檢測模式，也會發生干擾[16]。在這種情況下，IgM抗體不僅可能結合到IgM檢測點的抗人IgM上，還可能結合到相鄰IgG檢測點的病原體抗原上（詳見補充信息1）。
目前防止干擾的策略通常包括將檢測方法分離到獨立的通道或腔室中[17,18]。雖然這些方法有效，但它們本質上仍然是并行的單參數檢測通道，并未實現真正的多重檢測。另一種策略是在單個通道內使用水平層流來保持試劑流之間的空間分離[[19], [20], [21]]。然而，這種方法通常需要主動泵送系統來維持穩定的流動界面，并且經常依賴不相溶或多相系統來最小化交叉擴散。這些要求增加了復雜性，并引發了關于生物相容性的擔憂，因為非水相可能會影響免疫檢測中關鍵蛋白質的穩定性和功能。更復雜的解決方案，如帶有集成延遲閥或外部流體控制系統的復雜通道網絡[[22], [23], [24], [25]]，通常會引入制造挑戰、增加成本并降低魯棒性，從而限制了其在POCT中的應用。
在這項研究中，提出了一種基于層流的分層微流控（LF-HM）芯片。該芯片利用穩定的層流在單個微通道內形成兩個垂直分離的反應層，有效地隔離了不同的檢測方法，從而解決了干擾問題。首先通過數值仿真對芯片的流體行為和操作可靠性進行了建模，隨后通過實驗驗證了其穩定性。這項工作為微流控診斷中的無干擾多重檢測提供了一個多功能、集成的平臺。
試劑和材料
環狀瓜氨酸化肽（CCP）購自上海桑貢生物科技有限公司。類風濕因子抗原（人IgG Fc片段）和類風濕因子抗體（IgM，1100 IU/mL）購自江蘇愛�？瞪锟萍加邢薰�。兔抗IgG抗體、聚乙二醇（PEG）和鏈霉親和素（SA）購自美國馬薩諸塞州伯靈頓的Sigma-Aldrich Trading Co., Ltd.（中國上海分公司）。雞IgY抗體和兔抗...
微通道中層流的數值模擬
為了驗證LF-HM芯片的操作可靠性和設計原理，我們對三種操作條件下的流體動力學進行了有限元分析。
首先，樣品加載驗證了磁控止回閥的主要功能。如圖3A所示，閥門內的多孔聚合物基質產生的毛細作用吸入了樣品液體，防止其過早進入標記區并重新溶解標記物
結論
本研究提出了一種新型的分層微流控芯片，該芯片利用層流克服了不同檢測模式之間的干擾。通過結合數值模擬和實驗，我們證明了在優化條件下的精確流體控制和穩定的流分離。分析驗證表明，多重檢測保持了與單參數檢測方法相當的穩健性和準確性，并且與已建立的臨床方法具有強相關性，適用于人血清樣本。
作者貢獻聲明
楊曉輝：撰寫 – 審稿與編輯，撰寫 – 原稿，方法學，研究，正式分析，概念化。李一賢：撰寫 – 原稿，研究，正式分析。程珊珊：方法學，研究。穆榮榮：數據管理。徐竹：數據管理。Josh Zixi Lee：資源協調。楊宇：撰寫 – 審稿與編輯，監督，概念化。李慧強：撰寫 – 審稿與編輯，項目管理，概念化。
資助
本研究得到了中國兩個大學-行業合作研究項目的資助：“基于微流控技術的呼吸道合胞病毒抗原快速檢測方法的建立”（1JS008）和“雙向微流控芯片的開發與應用”（1JS012）。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文所述的工作。
