《Synthetic and Systems Biotechnology》：Engineering of plant-derived P450scc for
de novo biosynthesis of pregnenolone
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本文針對傳統依賴哺乳動物CYP11A1的孕烯醇酮(Prn)生物合成途徑存在效率低、系統兼容性差的問題，聚焦植物源P450scc酶催化機制不明、在異源微生物中轉化效率低的瓶頸，結合計算結構生物學與酶通道工程，揭示了毛地黃DlCYP87A的催化中間體，并通過底物通道與催化口袋的理性設計，在釀酒酵母中構建了高效合成系統，最終在5-L發酵罐中使工程菌株P4的孕烯醇酮產量達到1.46 g/L。該研究首次實現了植物源P450scc途徑的克級孕烯醇酮合成，為規模化生產甾體藥物前體奠定了關鍵技術基礎。
甾體激素（如雌激素、雄激素）是調控生殖、發育和全身生理功能的核心調節因子，也是內分泌、腫瘤和激素替代療法等領域的重要治療藥物。所有下游甾體產物的通用前體是孕烯醇酮（Prn, pregnenolone），其合成關鍵步驟是甾醇側鏈的裂解，這一過程普遍被認為是甾體激素生物合成的限速步驟。然而，傳統的生產方法主要依賴動物來源的P450scc（CYP11A1）系統，其復雜的線粒體定位信號、對特定電子傳遞伙伴（如ADR和ADX）的依賴，以及在微生物宿主（如釀酒酵母）中表達困難、活性低等問題，嚴重制約了其工業規模的生產效率，先前報道的產量多在每升數十毫克級別，難以滿足需求。相比之下，從毛地黃等植物中發現的CYP87A家族酶，能以更簡單的結構（與細胞色素P450還原酶CPR協同，定位于內質網）實現甾醇側鏈裂解，為高效合成提供了新思路。但植物源P450scc的催化機制尚不明確，在異源系統中也面臨轉化效率低的關鍵瓶頸。為了破解這一難題，研究人員開展了一項整合酶工程與系統生物學的綜合性研究。
為了開展研究，研究人員運用了多項關鍵技術方法：
- 1.
計算結構生物學與分子模擬：利用AlphaFold3預測DlCYP87A結構，通過CAVER進行底物通道分析，并采用分子對接與分子動力學模擬研究酶-底物相互作用。
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酶理性設計與工程：基于結構分析，對底物通道瓶頸位點（如I206, P213）和催化口袋關鍵殘基（如S111）進行丙氨酸掃描及飽和突變，構建并篩選了一系列酶突變體。
- 3.
轉錄組學引導的細胞器工程：對工程酵母菌株進行RNA測序分析，鑒定出與線粒體、內質網功能相關的差異表達基因（如COR1, ERO1），并對其進行靶向過表達以優化宿主細胞工廠性能。
- 4.
發酵工藝優化與代謝分析：在5-L生物反應器規模進行分批補料發酵，系統研究不同pH（5.0, 5.5, 6.0）條件對菌株生長、代謝物（葡萄糖、乙醇）消耗及孕烯醇酮產量的影響。產物定量采用氣相色譜、高效液相色譜-質譜聯用等技術。
研究結果
3.1. 篩選用于構建最佳Prn合成途徑的P450scc
研究人員系統評估了動物源和植物源P450scc對膽固醇和菜油甾醇途徑的底物特異性。結果顯示，來自毛地黃的DlCYP87A對菜油甾醇表現出最高的催化活性，產生127.6 mg/L的Prn。截短N端線粒體靶向信號肽對CYP87A活性影響甚微。最終，DlCYP87A被選為后續工程優化的候選酶。
3.2. CYP87A底物進入通道的理性工程
通過對DlCYP87A結構進行通道分析，發現其底物通道在12-16 ?處存在明顯瓶頸。對瓶頸附近殘基進行丙氨酸掃描，發現I206A突變體（M1）顯著提高了催化效率。基于分子動力學模擬識別的動態瓶頸位點，進一步對P213進行飽和突變，獲得P213S突變體（M2），其Prn產量提升至189.7 mg/L，且酶結構剛性增強。
3.3. 工程化P450scc在雙羥化與側鏈裂解之間的功能切換
在優化底物通道后，研究人員聚焦于催化口袋的改造。結構分析揭示了催化口袋附近存在影響底物取向的疏水區和穩定過渡態的氫鍵區。疏水區改造中，S111L突變體（M4）將Prn產量進一步提高至204.9 mg/L。分子動力學模擬表明，M4比M2具有更穩定的結構和更穩固的底物結合。然而，旨在強化氫鍵網絡的突變（如F281Y, M5）雖然增加了預測的氫鍵數量，卻導致底物與Fe-O催化中心距離增加，并未提高產量。
3.4. 通過轉錄組為基礎的回路設計優化細胞器功能
轉錄組分析發現，工程菌株中線粒體復合物III組裝、能量代謝以及內質網蛋白轉運折疊相關基因顯著下調。靶向過表達線粒體基因COR1（獲得菌株P4）和內質網基因ERO1（獲得菌株P5），分別將Prn產量提高至236.2 mg/L和340.7 mg/L。透射電鏡觀察證實細胞器工程導致了內質網的顯著擴增和細胞器整體尺寸的增加。
3.5. 在5升發酵罐中通過pH調控CYP87A功能
由于P450催化的Prn合成高度依賴NADPH，研究假設pH可能通過影響還原力分配來調節代謝流。在5-L發酵罐中測試了三種pH條件（5.0, 5.5, 6.0）。結果顯示，在pH 5.5條件下，工程菌株P4表現出最強的生理性能，包括快速的葡萄糖利用、高效的乙醇再同化和強勁的生物量積累，最終在144小時獲得了最高的Prn產量，達到1.46 g/L。pH 5.0或6.0的條件均會不同程度地干擾碳通量分布，降低催化效率。
研究結論與意義
本研究成功將植物源P450scc確立為微生物合成孕烯醇酮的高效催化劑。通過整合計算結構生物學、酶理性工程、轉錄組引導的細胞器優化以及發酵工藝調控，系統解決了植物源P450scc催化機制不明、異源表達效率低的瓶頸問題。
其重要意義體現在多個層面：在科學層面，該研究首次闡明了植物源DlCYP87A酶逐步羥基化-裂解的催化過程中的關鍵中間體，并通過系統的底物通道與催化口袋工程，厘清了其構效關系，深化了對植物P450催化機制的理解。在技術層面，研究實現了植物源P450scc途徑在釀酒酵母中克級（1.46 g/L）孕烯醇酮的從頭合成，這是該領域的首次突破，產量達到了工業化應用關注的里程碑水平。在應用與產業層面，這項工作為甾體激素藥物前體（如孕烯醇酮）的規模化、綠色生物制造開辟了一條全新的、具有自主知識產權的生產技術路徑，降低了傳統化學生產或依賴復雜動物源系統的成本和壁壘。此外，研究所展示的“酶機制解析-理性設計-宿主細胞器全局優化”一體化框架，為利用其他植物P450酶或復雜真核生物合成途徑生產高價值天然產物提供了可借鑒的合成生物學策略。該研究成果發表于《Synthetic and Systems Biotechnology》期刊，標志著我國在甾體化合物生物制造基礎研究與關鍵技術開發方面取得了重要進展。
