積雪草酸，一種五環三萜類化合物，因其卓越的抗炎、抗氧化、抗糖尿病和抗腫瘤等生物活性，在功能食品、藥品和化妝品領域備受青睞。然而，長期以來，這種寶貴的分子主要依賴從積雪草等植物中提取，過程不僅費時費力，產量也常受限。隨著合成生物學的發展，利用微生物“細胞工廠”來“綠色制造”高價值天然產物，成為了一條極具前景的新途徑。其中，面包酵母（釀酒酵母， Saccharomyces cerevisiae）因其遺傳背景清晰、培養簡單、遺傳工具豐富，成為了理想的生產平臺。但理想很豐滿，現實卻很“骨感”：當科學家們嘗試在酵母中重建積雪草酸的合成路徑時，遇到了重重關卡——關鍵前體供應不足、異源途徑引入帶來的細胞毒性、核心催化酶（尤其是細胞色素P450）效率低下，以及整個細胞代謝的失衡。這些瓶頸嚴重制約了產量的提升，距離工業化生產的目標依然遙遠。發表在《Synthetic and Systems Biotechnology》上的這項研究，正是為了攻克這些難題，旨在通過系統性的工程學策略，打造一個能夠高效、穩定生產積雪草酸的超級酵母菌株。

為了開展這項研究，研究人員運用了多種關鍵技術方法。在菌株構建層面，采用了CRISPR-Cas9基因編輯系統進行精確的基因敲除與敲入，并利用多拷貝基因組整合（如Ty位點整合）策略來增強關鍵基因的表達。在代謝工程中，運用了啟動子強度篩選、蛋白質降解標簽（N-degron）技術來精細調控競爭性代謝通量。為應對產物細胞毒性，創新性地結合了拉曼光譜（Raman spectroscopy）進行原位、無標記的產物細胞內分布分析，并以此為指導進行脂滴（lipid droplet）相關基因的工程化改造。在優化核心P450酶催化效率時，采用了血紅素（heme）穩態平衡工程和蛋白質融合（含柔性linker）策略。此外，還實施了輔因子（如NADPH）供應平衡和線粒體呼吸鏈工程，以協調全局代謝與能量供應。發酵工藝則在5 L生物反應器中進行補料分批發酵，并通過動態調控葡萄糖流加速率來優化生產過程。

研究以高產角鯊烯的底盤菌株SQ1為基礎，通過引入來自枸骨的α-香樹脂醇合酶（IaAS1）和突變型角鯊烯環氧酶（ERG1^V249H/L343A），初步實現了α-香樹脂醇的合成。通過篩選不同強度的啟動子，發現強啟動子P_PGK1驅動IaAS1表達效果最佳。進一步將關鍵基因整合到多拷貝Ty3位點，使產量提升至79.85 mg/L。為減少與內源甾醇途徑的競爭，研究人員在關鍵酶ERG7的N端融合了不同的降解標簽（N-degron），其中K15標簽能最有效地將代謝流導向目標產物，使α-香樹脂醇產量達到137.9 mg/L。此外，通過強化乙醇同化途徑基因ADH2和ALD6的表達，補充了合成所需的前體乙酰輔酶A（acetyl-CoA），最終將α-香樹脂醇產量提升至159.65 mg/L。

由于三萜中間體的積累具有細胞毒性，研究人員利用拉曼光譜技術首次直觀地發現α-香樹脂醇主要儲存在細胞的脂滴中。基于此發現，他們對脂滴合成與分解相關基因（如DGA1， ARE1， ARE2， YEH1， YEH2）進行了動態調控。實驗表明，增強ARE1和ARE2的表達能顯著增加α-香樹脂醇的積累。進一步將這對基因組合整合到轉錄抑制子ROX1的基因座，并進行多拷貝整合，最終使工程菌株A28的α-香樹脂醇產量達到310.2 mg/L。拉曼光譜對比證實，經過脂滴工程改造的菌株擁有更大、更多的脂滴，從而有效緩解了細胞毒性，提高了細胞適應性。

為實現熊果酸（ursolic acid）的從頭合成，研究在A28菌株中引入了來自積雪草的C-28氧化酶（CaCYP716A83）和來自擬南芥的細胞色素P450還原酶（AtCPR1）。為改善P450酶的功能，研究人員通過敲除血紅素降解基因HMX1并過表達血紅素合成途徑中的限速酶（如HEM13），來增加輔基血紅素的供應，使熊果酸產量提升至140.45 mg/L。隨后，他們采用了蛋白質融合策略，將CaCYP716A83與AtCPR1通過不同的柔性連接肽（linker）連接起來，以縮短電子傳遞距離。其中，CaCYP716A83-GSG1-AtCPR1融合蛋白效果最優。將該融合蛋白編碼基因整合到多拷貝Ty4位點后，構建的UA15菌株熊果酸產量達到212.2 mg/L。

異源途徑的引入容易導致細胞氧化還原失衡。為此，研究人員嘗試增強胞質NADPH的供應，發現過表達蘋果酸酶基因MAE1效果顯著，使熊果酸產量增至241.3 mg/L。此外，線粒體作為細胞的“動力工廠”，其呼吸鏈效率直接影響細胞的整體代謝狀態。通過增強線粒體內膜呼吸鏈復合物IV中細胞色素c（CYC1）等基因的表達，可以有效促進細胞有氧呼吸和碳源利用。最終，工程菌株UA20的熊果酸產量達到了283.3 mg/L。

積雪草酸由熊果酸在C-23和C-2α位經羥基化生成。研究以UA20為底盤，引入負責這兩個羥基化步驟的酶：CaCYP714E19和CaCYP716C11。通過篩選不同植物來源的CPR，發現來自蒺藜苜蓿的MtCPR與CYP的兼容性最好。為了縮短不同P450酶之間的空間距離，研究人員引入了膜結合支架蛋白（MSBP），如來自擬南芥的AtMSBP1，它能有效促進酶促級聯反應，使搖瓶中的積雪草酸產量提升至35.8 mg/L。通過優化發酵條件（如葡萄糖添加量為50 g/L），最終在搖瓶中獲得了46.2 mg/L的積雪草酸。

為評估生產潛力，研究在5 L生物反應器中進行了補料分批發酵。通過分階段動態調控葡萄糖流加速率，以控制乙醇積累，并在接種時添加0.4 g/L FeSO₄·7H₂O以提供P450酶所需的鐵元素，最終在120小時發酵后，積雪草酸的效價達到了170.4 mg/L。

結論與討論 本研究成功構建了一個用于高效合成積雪草酸的模塊化工程酵母底盤。其核心在于通過多層次代謝工程策略，系統性解決了從上游前體供應、中游細胞毒性緩解，到下游核心酶優化及全局代謝平衡的一系列關鍵科學問題。具體而言，研究通過啟動子工程、競爭途徑弱化（利用N-degron技術）和乙酰輔酶A回補，大幅提升了關鍵前體α-香樹脂醇的產量。創新性地結合拉曼光譜分析與脂滴工程，可視化并解決了三萜積累的細胞毒性難題，為疏水性天然產物的微生物合成提供了新思路。針對P450酶這一限速步驟，通過平衡血紅素穩態、采用融合蛋白策略，有效提升了熊果酸的合成效率。進一步的線粒體工程與輔因子供應協調，則從系統層面優化了細胞的代謝流和能量狀態。最終，在這個高度優化的平臺上引入下游羥基化酶，成功實現了積雪草酸的從頭生物合成，并在5 L規模發酵中取得了突破性產量。這項工作不僅為積雪草酸的工業化微生物生產奠定了堅實的技術基礎，更重要的是，它所展示的“從分子機制到細胞工廠”的多層次、模塊化工程策略，為解決其他具有細胞毒性的高價值萜類化合物的生物合成難題提供了一個可借鑒的、系統性的工程生物學框架。盡管工業級生產仍面臨挑戰，但該研究指明的方向——包括對關鍵P450酶的理性設計與動態調控等——將成為未來進一步突破的重要著力點。